MMP—2在早產兒視網膜病變新生小鼠模型中的表達

馬書梅

【摘要】 目的 檢測MMP-2在新生小鼠模型中的表達，探討MMP-2在早產兒視網膜病變發病過程中的作用。方法 將7 日齡C57BL/6J小鼠置于75%plusmn；2%高氧環境中，5 天后再置于正常空氣環境中，建立高氧誘導的早產兒視網膜病變的小鼠模型。于鼠齡17 天時處死動物并摘除眼球，應用免疫組化方法檢測視網膜組織中MMP-2的表達情況。結果 MMP-2在對照組和高氧組的積分光密度值分別為16.33plusmn；4.13和21.12plusmn；6.29，兩者比較有顯著性差異（t=3.160，Plt；0.01）。結論 MMP-2可能對早產兒視網膜病變的新生血管生成有一定作用。

【關鍵詞】 早產兒視網膜病變；MMP-2；視網膜新生血管

【中圖分類號】R774.1 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0086-03

早產兒視網膜病變（Retinopathy of prematurity，ROP）是發生于早產和低體重兒的一種致盲性視網膜病變，其病理特征為視網膜血管異常增生，嚴重者可引起玻璃體出血、視網膜變性、視網膜脫離等多種并發癥。上世紀80年代以來，由于醫療技術的快速發展，早產兒的成活率也顯著提高，ROP的發病率也隨之呈上升趨勢，在體重低于1 000 g的超低體重兒，發病率高達80%以上[1，2]。目前，ROP已經成為世界范圍內兒童致盲的重要原因，約占兒童致盲原因的6%～18%[3]。防治ROP以改善早產兒的生存質量己成為全球關注的焦點。己經明確ROP與吸氧治療高度相關，早產、高氧和低出生體重是發病過程中最為關鍵的因素，但其發病的確切機制至今仍不明確。

研究表明，視網膜新生血管形成在ROP的發病機制中起主導作用。盡管近年來人們對視網膜新生血管的認識研究有了不少突破，但由于其確切發病機制仍然不明，目前臨床上尚無完全根治性手段。在對視網膜新生血管發生機制的研究中，諸多生長因子、細胞因子和炎癥介質發揮的作用一直是關注的重點。近些年來，對基質金屬蛋白酶的研究成為熱點。

本研究在早產兒視網膜病變的小鼠模型中，應用免疫組化方法，檢測了基質金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達，進一步探討MMP-2在早產兒視網膜病變發病過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

中國醫科大學附屬盛京醫院動物實驗中心提供的健康的清潔級C57BL/6J幼鼠（與哺乳母鼠在一起），選擇鼠齡7 天的共40 只，雌雄兼有。

1.2 實驗試劑

MMP-2免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 早產兒視網膜病變小鼠模型的建立

選擇鼠齡7天的健康清潔級C57BL/6J幼鼠40 只，與哺乳母鼠在一起，雌雄兼有，隨機分成2組，高氧組20 只，對照組20 只。對照組在正常環境溫度下飼養；高氧組置于密閉有機玻璃容器內。容器內接入100%濕潤醫用純氧氣，使容器內氧分壓保持在75 %plusmn；2 %，并用測氧儀全程監測容器內的氧分壓，確保氧濃度的恒定。高氧環境下飼養5天，然后移置正常環境溫度中飼養。每天日光照明12小時，環境溫度控制在（23plusmn；2）℃。每日打開氧箱更換墊料、加食、替換母鼠1次。

1.4 標本的制備

鼠齡17 天時處死幼鼠，將眼球摘除，浸泡于4 %多聚甲醛中性緩沖液中固定24 小時，保存溫度為4 ℃。梯度酒精脫水、二甲苯透明，常規石蠟包埋。標記方向，制作切片時應避開視乳頭周圍，含有視神經的切片應排除在外。連續切片，厚度6 mu；m，切片方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位平面。

1.5 免疫組化法

按照即用型SABC免疫組化試劑盒使用說明書進行操作：石蠟切片置于60 ℃烘箱2～3小時溶解石蠟，二甲苯常規脫蠟至水，0.3%過氧化氫室溫孵育5～10 分鐘，切片置于抗原修復液中92～98 ℃水浴10 min，室溫中冷卻20 min。滴加5%BSA封閉液，滴加適當稀釋的一抗（1：150），4 ℃過夜。次日滴加生物素標記的二抗工作液，置濕盒內37 ℃，滴加試劑SABC，室溫孵育30 min。DAB顯色：使用DAB顯色劑試劑盒，取蒸餾水1 mL，加試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后加至切片，室溫避光10 min。蘇木素復染1 min，脫水、透明、封片、鏡下觀察。

1.6 統計學分析

實驗數據采用均數plusmn；標準差表示，所有數據均以統計分析軟件SPSS 11.5 for windows 進行分析，采用獨立樣本t檢驗方法，以Plt；0.05作為差異有統計學意義的標準。