巢式一實時熒光定量PCR法檢測慢性乙型肝炎患者PBMC中HBVcccDNA的實用性評估

楊慧慧

【摘要】 目的 評估巢式-實時熒光定量PCR法檢測慢性乙型肝炎患者PBMC中HVB cccDNA的實用性。方法 利用巢式-實時熒光定量PCR法檢測慢性乙型肝炎患者肝組織和PBMC中HVB cccDNA水平。結果 20例血清HBV DNA均為陽性的慢性乙型肝炎患者肝組織和外周血PBMC中ccDNA陽性率分別為55%（11/20）和45%（9/20），兩者的符合率為90%。結論 利用巢式-實時熒光定量PCR法檢測慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA能較真實地反映HBV的復制。該方法可能是一種評價抗病毒藥物的療效，觀察乙型肝炎患者病情的變化的有效手段，具有很強的實用性。

【關鍵詞】 肝炎病毒，乙型；DNA，環狀；聚合酶鏈式反應；單核細胞

【中圖分類號】R51216 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0048-02

乙型肝炎病毒（HBV）復制有其獨特的地方，首先形成共價閉合環DNA（covlently closed circular DNA，cccDNA），然后轉錄成前基因組RNA，最后在逆轉錄酶的作用下合成病毒基因組DNA，故cccDNA是HBV復制的突出標志[1]。cccDNA主要存在宿主的細胞核，既往均采用肝組織檢測DNA，但取材困難，限制了臨床應用。研究發現外周血淋巴細胞同樣存在HBV感染復制現象[2，3]，故檢測外周血HBV cccDNA同樣能反映HBV復制狀況及評價藥物療效，且比肝組織更方便，只是外周血cccDNA濃度較低，易出現假陰性。為了評估巢式-實時熒光定量PCR法在檢測慢性乙型肝炎患者PBMC中HVB cccDNA的實用性，筆者擬利用巢式-實時熒光定量PCR法同時檢測慢性乙肝患者肝組織和PBMC中HVB cccDNA的含量，以期為臨床檢測HCV復制狀況及評價藥物療效提供簡便有效的方法。

1 材料與方法

1.1 標本 選取長沙市第一醫院傳染科確診的慢性乙型肝炎患者20例，男13例，女7例，平均年齡46.8歲（28～65歲），所有患者均未進行任何治療。每例病例分別采取全血10ml和行肝穿刺獲取肝組織；全血采用密度梯度離心法分離PBMC，洗滌5次后檢測上清液中HBV DNA，確認HBV DNA PCR結果為陰性后，計數細胞，取1×106細胞備用。肝組織用生理鹽水清洗4次，入液氮保存備用。aywHBV全序列的pcp10質粒，采用p-GEM-T-Easy載體構建，用作檢測HBV cccDNA的陽性參照定量標準品，提取陽性標準質粒，測定核酸濃度，倍比稀釋為5.0×102～5.0×109拷貝/ml，作為陽性標準品對照。

1.2 引物與探針的設計及合成 根據HBV cccDNA與松弛結構DNA（rcDNA）結構上的差異，跨HBV DNA雙鏈缺口兩側選擇區域設計2對內外引物，并在負鏈缺口下游設計TaqMan熒光探針。所有設計的引物能選擇性地擴增HBV cccDNA，而不能擴增rcDNA。P1引物：5-CGC TTT CGG GTC CCT CAT GCG ACG TGC-3，P2引物：5-TCG CTT TCG GGT CCC T-3，P3引物：5-GCA CCT CTC TTT ACG CGG TC-3，P4引物：5-AAC TGA AAG CCA AAC AGT G-3，TaqMan熒光探針：5-FAM-CTC TGC C-TAA TCA TCT CAT GTT CAT-TAMRA-3，外引物擴增片段為385bp，內引物擴增片段為105bp。

1.3 主要試劑 基因組提取試劑盒、HBV DNA熒光定量PCR檢測試劑盒、質粒抽提試劑盒均購自北京索奧生物技術公司，CR Master Mix試劑購自日本東洋坊公司。

1.4 DNA抽提 利用質粒抽提試劑盒按說明書操作提取PBMC及肝組織中病毒DNA。

1.5 巢式-實時熒光定量PCR擴增 取純化模板2μl，用外引物進行第一輪常規PCR擴增。外引物P1和P2濃度為10μmol/L，各1μl，10mmoldNTP 0.5μl，Taq酶0.5μl，10×buffer 2μl，ddH2O 13μl；循環條件：94℃ 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，40個循環；72℃ 5min。第二輪反應用內引物和熒光探針對第一輪PCR產物中的目的片段進行實時熒光定量擴增。反應體系為：第一輪PCR產物2μl，2×Taq PCR Master Mix 12μl，P3、P4引物各1μl，10μmol/L熒光探針0.5μl，反應總體積20μl；循環條件：94℃ 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，40個循環；72℃ 5min。設陽性標準品對照為aywHBV全序列的pcp10質粒，陰性對照為3例健康獻血員。

2 結 果

2.1 肝組織和外周血中PBMC中cccDNA檢測結果 第一輪PCR產物電泳在385bp處見陽性條帶，第4，6，7，8，10，12，13泳道呈陽性（圖1）。20例血清HBV DNA均為陽性的慢性乙型肝炎患者肝組織中ccDNA陽性者10例，陽性率為50%（10/20）。cccDNA定量值為4.214×104～5.211×105拷貝/ml。外周血PBMC中cccDNA陽性者9例，陽性率45%（9/20）。cccDNA定量值為3.521×103～3.452×104拷貝/ml。3例健康獻血員PBMC中cccDNA均陰性。

2.2 外周血PBMC和肝組織中cccDNA陽性的符合率 9例外周血PBMC中cccDNA陽性患者的肝組織中cccDNA均陽性，但有1例肝組織中cccDNA陽性患者其外周血PBMC中cccDNA陰性，外周血PBMC和肝組織中cccDNA陽性的符合率高達90%（9/10）。

2.3 方法的敏感性 檢測pcp10陽性參照定量標準品，得到該方法的靈敏度為2log10拷貝/ml范圍，隨著模板量減少，對應CT值增大，呈線性相關，獲得標準曲線（圖2）。

3 討 論

臨床上一般以HBV DNA載量作為抗病毒治療依據及判斷乙肝病毒復制活力，HBV DNA包括rcDNA和ceeDNA。有學者認為單純依靠血清HBV DNA檢測是不夠的，應結合HBV cccDNA的檢測和臨床來進行綜合分析，才能更真實地反應患者體內乙肝病毒的復制，為臨床治療提供更為可靠的依據[4]。cccDNA的清除預示著HBV在宿主體內生命周期的終結，因此不少學者認為這是最佳的抗病毒參考指標之一[4]。HBV cccDNA的檢測能夠評價抗病毒藥物的療效，連續觀察更能反映乙型肝炎患者病情的變化，所以準確、方便、快速檢測cccDNA的量是目前乙肝治療的迫切要求。乙型肝炎病毒HBV cccDNA研究以肝組織為多，但肝組織取材困難，臨床應用受到了極大的限制。HBV可以感染白細胞，而這種免疫細胞的感染有利于病毒免疫逃逸，不被免疫細胞攻擊，從而導致機體清楚HBV能力下降，故外周血PBMC中存在HBV感染和復制，檢測外周血PBMC中cccDNA應該亦能反映HCV的復制，但血液中cccDNA的水平遠遠低于肝組織，檢測亦較為困難。

巢式-實時熒光定量PCR技術具有高靈敏性和高特異性，能夠檢測極其微量的DNA。cccDNA有共價、閉合、超螺旋雙鏈DNA結構，在堿變性后可再復性，而rcDNA是有缺口的雙鏈DNA，堿變性后不可復性 所以本實驗方法應用質粒提取試劑盒抽提肝組織和PBMC中的病毒DNA可以祛除rcDNA、單鏈DNA和RNA，對cccDNA進行純化，可進一步提高cccDNA檢測的靈敏性和特異性[5]。

本研究結果顯示，利用巢式-實時熒光定量PCR技術對20例血清HBV DNA陽性的慢性乙型肝炎患者的肝組織和PBMC中的cccDNA進行檢測，發現肝組織和PBMC中cccDNA的陽性率分別為50%和45%，且兩者的符合率高達90%，表明利用巢式-實時熒光定量PCR技術檢測外周血PBMC中的cccDNA亦能較真實的反映HBV的復制，可以避免由于肝組織取材帶來的限制，且準確、方便、快捷，是一種評價抗病毒藥物的療效，觀察乙型肝炎患者病情的變化的有效手段，具有很強的實用性。

參考文獻

[1]陳延平. 檢測HBVcccDNA的巢式-實時熒光定量PCR方法的建立及初步應用[D].第四軍醫大學，2007.

[2]陳勇. 實時熒光定量PCR檢測HBV cccDNA體系建立及臨床應用初步研究[D].重慶醫科大學，2008.

[3]陳延平，孟存英，徐光華，馮繼紅，王平忠，白雪帆. 應用巢式-實時定量PCR方法檢測慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA[J]. 肝臟，2011，05：401-404.