左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中μ—calpain及caspase—3表達的影響

韓麗萍 王海燕 喬霜等

【摘要】康模罕狙芯渴峭ü鄄霯EV對癲癇大鼠認知情況及海馬組織中μ-calpain和caspase-3表達的影響，來探討LEV的抗癲癇作用及其機制。方法：取三周齡Wistar大鼠隨機分為四組：NS組、LEV組、Li-pilo組和Li-pilo+LEV組。采用氯化鋰-匹羅卡品誘導建立癲癇大鼠模型，建模成功24 h后，LEV組和Li-pilo+LEV組分別給予200 mg/（kg·d） LEV。采用Morris水迷宮評價大鼠的學習與記憶的能力，免疫組織化學法檢測各組大鼠海馬組織中的μ-calpain及caspase-3的表達水平。結果：1.與NS組相比，LEV組的逃避潛伏期和穿越平臺次數無顯著差異 （P>0.05）；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的逃避潛伏期顯著縮短，而穿越平臺次數則顯著增加（P<0.05），但未恢復到正常水平。2.與NS組相比，LEV組的μ-calpain和caspase-3的蛋白表達無顯著變化（P>0.05）；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的μ-calpain和caspase-3的蛋白表達則顯著減少（P<0.05），但未恢復到正常水平。結論：LEV 可以改善癲癇大鼠的學習和記憶的能力，該作用可能是通過調節海馬組織中的μ-calpain及caspase-3的表達實現的。

【關鍵詞】左乙拉西坦；癲癇；μ-calpain；caspase-3

【中圖分類號】R722.12 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）03-0095-02

癲癇（epilepsy）是神經系統最常見的疾病之一，全球約有3500萬患者，患病率為5%～7%，而我國也約有650萬患者正在遭受該病的困擾。癲癇是一組以腦部功能失常為特征的綜合征，具有突然的發作性，重復性，和短暫性為特點。可以說是兒童期最為常見的神經系統疾病之一。而癲癇持續狀態（status epilepticus， SE）是癲癇的嚴重狀態，是癲癇反復發作或持續狀態，可以造成神經細胞的凋亡和壞死，并引起認知功能的損害。左乙拉西坦（Levetiracetam， LEV）作為國際上公認的一種抗癲癇藥物（antiepileptic drugs， AEDs）的新品種，憑借其獨特的抗癲癇機制，臨床效果的高效和安全性及良好的藥物動力學特點，目前已經在國內和歐美廣泛應用于對癲癇的治療。LEV具有抗癲癇和神經保護雙重作用[1]。王海燕等[2]在研究中發現左乙拉西坦在治療癲癇的同時，還會改善癲癇大鼠的認知功能。張巖等[3]在左乙拉西坦對癲癇大鼠認知功能的影響研究中也觀察到，左乙拉西坦可改善癲癇大鼠的學習記憶能力。本研究主要采用免疫組織化學染色法檢測LEV對癲癇大鼠海馬組織中μ-鈣蛋白酶（μ-calcium-activated non-lysosomal protease，μ-calpain）及半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）蛋白表達的影響，并采用Morris水迷宮法檢測大鼠空間記憶和學習能力，來探討LEV抗癲癇作用的機制及其對認知的影響。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物及模型制備

取三周齡健康Wistar大鼠（55±10g）124只（佳木斯大學動物實驗中心提供），雌雄不限，隨機的分為四組：正常對照組（NS）28只，左乙拉西坦對照組（LEV）28只，癲癇對照組（Li-pilo）34只，左乙拉西坦治療組（Li-pilo+LEV）34只。

參考文獻制備癲癇大鼠模型：Li-pilo組和Li-pilo+LEV組的大鼠首日腹腔注射1.27%氯化鋰127 mg/Kg，24h后再給予M膽堿受體阻滯劑丁溴東莨菪堿1 mg/Kg，30min后腹腔注射1% 匹羅卡品100 mg/Kg。觀察大鼠行為變化的情況。根據Racine分級標準[4]，將達到Ⅲ～Ⅴ級進入癲癇持續狀態的大鼠歸于致癇成功組；未達到Ⅲ～Ⅴ級的大鼠，繼續注射匹羅卡品直至注射次數達到6次，若注射6次后仍未達到標準，則歸于致癇不成功組，棄之不要。將造模成功大鼠繼續分為Li-pilo組和Li-pilo+LEV組。NS組及LEV 對照組均在相同時間點給予等體積的生理鹽水。

1. 2 方法

1.2.1 給藥方案 Li-pilo+LEV組和LEV組在成模24h后給予200 mg/（kg·d） LEV灌胃，Li-pilo組和NS組給予等體積的生理鹽水灌胃，每日在相同時間點給予一次灌胃。

1.2.2 留取標本及檢測指標

（1）癲癇模型制備成功24h后，采用Morris水迷宮法每日測試各組大鼠的行為學指標：①定位航行實驗：每天分為2個時間段，每個時間段訓練大鼠4次，一共需要4天完成，觀察并記錄大鼠在60s內找到平臺的時間（逃避潛伏期，escapelatency），反應大鼠空間學習和記憶能力；②空間搜索實驗（spatial probe test）：即在第5d將平臺撤掉，觀察和記錄大鼠90s內穿越平臺的次數，用于測量大鼠對空間位置的記憶能力。

（2）LEV給藥后的第7、14、28天每組隨機選取8只大鼠，給予10%水合氯醛麻醉之后，斷頭處死，分離出大鼠的海馬組織，在 -70℃給予保存，免疫組化染色法檢測大鼠海馬組織中μ-calpain及caspase-3的表達情況。

1.2.3 檢測試劑 LEV購于美國sigma公司；μ-calpain及caspase-3抗體及免疫組化試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 統計學分析 使用SPSS 16.0軟件進行統計分析，實驗數據為計量資料，用 表示，組間差異比較采用方差分析，有統計學意義時進一步用LSD法做兩兩比較。檢驗水準α為0.05。

2 結果

2.1 Morris水迷宮測試

與NS組相比，LEV組的逃避潛伏期和穿越平臺次數無顯著差異 （P>0.05）；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的逃避潛伏期顯著縮短，而穿越平臺次數則顯著增加（P<0.05），但未恢復到正常水平。（見表1）