新生BALB/c小鼠口服滅活幽門螺桿菌對特異性抗體的影響作用

楊鈺欣 江吉富

【摘要】目的：探索BALB/c小鼠新生期口服滅活幽門螺桿菌（H.pylori）后能否產生特異性sIgA與IgG。方法：將24只BALB/c小鼠分為三組進行實驗。第Ⅰ組為PBS對照組，第II組為滅活H.pylori組，第Ⅲ組為滅活H.pylori加大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（LTB）組。用相應抗原成分對各組出生24小時以內的新生BALB/c小鼠進行灌胃免疫，末次免疫兩周后，檢測小鼠血清抗幽門螺桿菌IgG及胃粘膜抗幽門螺桿菌sIgA。結果：Ⅰ、II、Ⅲ組血清特異性IgG濃度分別為2.1±0.67、8.84±1.07、37.50±4.87ng/ml；胃粘膜特異性sIgA濃度分別為1.60±0.49、1.96±0.47、6.56±1.24ng/ml。Ⅲ組血清IgG濃度與胃粘膜sIgA濃度分別與Ⅰ、II進行比較，結果顯示差異有統計學意義（P<0.05）；II組血清IgG濃度與其余兩組進行比較分析，結果顯示差異有統計學意義（P<0.05），而該組sIgA濃度與其余兩組的比較顯示差異無統計學意義（P>0.05）。結論：在BALB/c小鼠新生期給予滅活幽門螺桿菌與LTB灌胃免疫后能使機體胃粘膜特異性sIgA與血清IgG顯著增高。

【關鍵詞】滅活幽門螺桿菌；LTB；新生BALB/c小鼠。

【中圖分類號】R341【文獻標識碼】B【文章編號】1005-0019（2015）01-0088-01

前言

幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，H.pylori）是人類最常見的病原菌之一，主要定植于人胃內。它是導致慢性胃炎，十二指腸和胃潰瘍以及胃癌的一個重要致病因子。除此之外，它還是胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤發展的一個重要因素，WHO將其歸為I類致癌因子。幽門螺桿菌感染在全世界廣泛流行，研究顯示，全球已有48%的人感染這種細菌，發展中國家的感染率高達68%。其主要在兒童期感染，5歲以下幼兒具有較高的再感染率，目前，H.pylori感染臨床治療尚以三聯療法為主。但存在著細菌耐藥率逐年增加、患者依從性差、以及容易再次感染等諸多問題。H.pylori感染是一類特殊的感染，它生存于胃粘膜細胞外。根據這一特性，相關研究認為預防和治療H.pylori感染的主要方式是阻止粘膜發生免疫耐受，并誘導粘膜層產生粘膜免疫應答反應。sIgA作為主要的粘膜保護性抗體，它的主要作用是能夠防止細菌和病毒在粘膜表面定植和進一步感染，可抑制細菌抗原的攝取、阻止H.pylori的粘附、移動，以及中和毒素，但其在胃腸外基本無效[1]。因此，目前H.pylori疫苗的免疫接種方法主要是通過口服，由于多數抗原經口服后其免疫原性都非常弱，不能靶向地被運載至腸道的粘膜免疫系統；同時，這些抗原極易被消化和降解，且胃腸的吸收率較低，常規免疫劑量無法刺激機體產生足夠的免疫應答反應。要研制有效的H.pylori口服疫苗，除了要確立有效的抗原成分外，選擇合適的免疫佐劑非常重要。大量研究證實LTB（大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位）能有效地誘導粘膜免疫的產生，且與LT（大腸桿菌不耐熱腸毒素）的另一亞單位LTA（大腸桿菌不耐熱腸毒素A亞單位）相比，具有明顯的低毒性。由鄒全明等人研制的用LTB作為分子內佐劑的口服重組H.pylori亞單位疫苗在臨床試驗中取得了良好的效果[2]。根據流行病學調查顯示，H.pylori的感染在出生后0—1歲就已有發現[3，4]。這樣看來，似乎在新生期接種疫苗才能達到預防H.pylori感染的目的。因此，在本實驗中選用LTB作為粘膜佐劑，對新生小鼠進行灌胃免疫，并觀察其免疫效果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與儀器哥倫比亞瓊脂培養基、H.pylori培養選擇性添加劑購自英國OXIOD公司；布氏肉湯購自杭州天和有限責任公司；三元混合氣體（O2、CO2、N2）購自貴陽申建氣體有限責任公司；LTB購自Sigma公司；抗H.pyloriIgGELISA檢測試劑盒及抗H.pylorisIgAELISA檢測試劑盒購自BG公司。恒溫培養箱（DHP-9272）購自上海一恒有限責任公司；酶標儀（MK3）購自美國Thermo公司；細菌比濁儀（VITEM004120）購自法國生物梅里埃公司。

1.1.2菌株幽門螺桿菌NCTC11637（購自中國疾病預防控制中心傳染病防治研究所）。

1.1.3動物模型BALB/c小鼠（購于中國藥品生物制品檢定所），清潔級，雌雄兼用，自由飲水，分籠飼養。

1.2實驗方法

1.2.1H.pylori滅活全菌體的制備

將NCTC11637接種于含5%無菌脫纖維綿羊血的哥倫比亞血瓊脂平板上，置密封的玻璃培養罐內，充入混合氣體（O2：5%、CO2：10%、N2：85%），37℃恒溫培養，3～4天后取出，用PBS從平板上洗脫，置60℃水浴箱1小時，使細菌滅活，取滅活菌液接種到哥倫比亞血瓊脂平板，按上述條件進行培養，3～5天后觀察無活菌生長。然后將收集的菌液離心，5000r/min，20分鐘，濃縮菌體，去掉上清液，用PBS清洗兩次，用比濁法配制成終濃度為2×109/ml的H.pylori滅活菌液，4℃保存備用。

1.2.2LTB的溶解

LTB臨用前用500μl超純水溶解，溶解時輕輕轉動，避免產生汽泡，LTB終濃度為1μg/μl，完全溶解后便可使用，余下可放-40℃短期保存備用。

1.2.3實驗分組

根椐不同的免疫劑型分為三組（如表1所示）。

表1實驗分組

分組疫苗組成對照組（I）（8/group） PBS疫苗A組（II）（8/group） 滅活的H.pylori疫苗B組（III）（8/group） 滅活的H.pylori+LTB1.2.4免疫方法

免疫動物與數量：均為出生后第0天（24h以內）BALB/c小鼠，共24只，16只/每組。免疫劑量：I組為50μlPBS，II組為50ul（含108CFU）滅活全菌，III組為50μl（含108CFU）滅活全菌加5μgLTB。免疫時間：出生后第0、7、21天。第0天灌胃兩次，兩次中間隔6小時；第7、21天各免疫1次。免疫程序：第0天免疫時，將24小時以內出生的BALB/c小鼠與母鼠分離3小時后，進行灌胃，灌胃完畢，繼續放入籠中（與母鼠隔離），4小時后，再次按照上述方法給予第二次灌胃，免疫結束2小時后，將母鼠放回籠中。第7、21天各免疫1次，第7天免疫前，與母鼠隔離6小時，免疫方法同前，免疫2小時后放回母鼠籠中。第21天免疫前斷食24小時，斷水4小時以后進行灌胃，免疫2小時后恢復食水。

1.2.5抗H.pyloriIgG、sIgA檢測

1.2.5.1標本采取

實驗組取末次免疫兩周后（第35天）小鼠，斷食12小時，斷水4小時，摘除眼球取血，置37℃半小時后，分離血清，-20℃保存備用，檢測特異性IgG。將取血致死的小鼠腹部剪開，從賁門處到幽門處剪取胃組織，去除胃內容物，用小剪刀將胃組織剪碎，再移置200目不銹鋼網上，然后加入1ml蒸餾水進行研磨，將研磨后的細胞懸液離心，5000r/min，離心20分鐘。取上清液，-20℃保存備用，檢測特異性sIgA。

1.2.5.2血清特異性IgG檢測

按照BG公司ELISA試劑盒說明書進行檢測。終止反應后30分鐘內在波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值，繪制標準曲線，計算濃度值。

1.2.5.3胃組織標本特異性sIgA檢測

按照BG公司ELISA試劑盒說明書進行檢測。終止反應后5分鐘內在波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值，繪制標準曲線圖，計算濃度值。

2結果（用SPSS17.0進行統計學分析）

各組血清特異性IgG，胃粘膜特異性sIgA濃度（如表2、圖1、2所示）

從表3-1中可以看出第Ⅲ組的特異性IgG及sIgA濃度明顯高于第Ⅰ、Ⅱ組，其中，Ⅱ組IgG濃度與Ⅰ、Ⅲ組相比，結果具有統計學意義（P<0.05），Ⅲ組IgG濃度與Ⅰ、Ⅱ組相比，結果亦具有統計學意義（P<0.05）；Ⅲ組sIgA濃度分別與Ⅰ組和Ⅱ組相比，結果具有統計學意義（P<0.05），Ⅰ組與Ⅱ組sIgA濃度無統計學意義（P>0.05）。

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4討論

早在90年代初期，有關H.pylori疫苗的研究就已經開始。近年來，有著各種各樣關于H.pylori疫苗的研究。根據疫苗的構成不同，可將其分為全菌疫苗、亞單位疫苗、表位疫苗、載體疫苗等。亞單位疫苗的結構與組成較為明確，是可引起免疫保護的一類蛋白質、脂多糖等微生物組分。與亞單位疫苗相比，全菌疫苗的優點是能誘發針對細菌各種抗原的免疫應答[5]。但是這些蛋白介導的免疫應答機制仍然不十分清楚，另一方面，現在仍然不能確定對H.pylori整個菌體有效的理想疫苗，應該誘導的免疫應答的效應因子是什么（例如抗體、CD4+亞群、細胞因子等）。本實驗通過檢測抗H.pylori特異性IgG及sIgA來觀察用滅活H.pylori加或不加LTB灌胃免疫新生小鼠后，能否誘導機體產生特異性免疫應答。結果顯示，抗H.pyloriIgG及sIgA濃度有所增高，提示滅活幽門螺桿菌加LTB能誘導機體免疫系統產生特異性的全身及粘膜免疫反應。雖然滅活H.pylori不加LTB組IgG濃度的增高與PBS組相比較具有統計學意義，但該組特異性sIgA卻未見明顯增高，這一結果證明了抗原經消化道免疫的特殊性（極易被消化和降解）及佐劑在粘膜免疫中的重要性[6]。因蛋白質包括疫苗到達粘膜誘導部位是一種誘導全身無應答性（粘膜誘導耐受性）的有效途徑，雖然粘膜誘導耐受是防止自身免疫疾病的有效途徑，但此特征可導致宿主對感染應答能力的喪失[7]。本實驗用LTB作為粘膜免疫佐劑，試圖增強滅活H.pylori在胃粘膜的的抗原性，結果顯示特異性IgG及sIgA抗體濃度較不加LTB組顯著增高，提示用LTB作為佐劑用于新生BALB/c小鼠的消化道粘膜免疫是可行的，這一結果與文獻報道相符[12]。雖然sIgA是公認的粘膜表面主要的免疫球蛋白，是機體抵抗外來病原體的第一道防線，它們幫助機體抵御病原體經由粘膜上皮的感染，防止病原體和毒素進入細胞[8]。但新生期免疫產生的這兩種抗體對于H.pylori的感染是否有免疫保護作用，我們將進一步進行探索研究。

參考文獻

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[2]鄒全明.幽門螺桿菌疫苗的研究進展[J].胃腸病學，2007；12（9）：567-570.

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[5]閆東梅，朱迅.治療性疫苗的發展現狀與應用前景[J].中國生物制品學雜志，2005；18（6）：535-537.

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[7]吳玉章，白云，程曉剛，etal（譯）.基礎免疫學[M].北京：科學出版社，2003，1023.

[8]何維.醫學免疫學[M].北京：人民衛生出版社，2005，76.