亞硝酸鹽對墨吉明對蝦的毒性及其免疫因子的影響

栗志民等

摘要[目的]為墨吉明對蝦的工廠化健康養殖提供理論依據。[方法]采用靜水生物毒性法研究亞硝酸鹽對墨吉明對蝦的24、48、96 h急性毒性效應，分析96 h半致死濃度脅迫下墨吉明對蝦血清蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力以及溶菌酶活力的變化。[結果]亞硝酸鹽毒性效應與亞硝酸鹽濃度和脅迫時間呈正相關。亞硝酸鹽對墨吉明對蝦24、48、96 h的半致死濃度分別為281.83、151.36和11482 mg/L，其安全濃度為11.48 mg/L。114.82 mg/L的亞硝酸鹽對墨吉明對蝦進行脅迫，在24～96 h范圍內墨吉明對蝦免疫指標隨著脅迫時間的延長而發生顯著變化，其中血清蛋白含量隨著脅迫時間的延長而呈先升高后下降的趨勢，且顯著低于對照組 （P<0.05）。墨吉明對蝦肝胰臟中超氧化物歧化酶（SOD）活力在48 h內呈下降趨勢，且48 h SOD活力最小（148.90 U/mg prot），而48 h后SOD活力逐步上升。在脅迫時間24～96 h范圍內，肝胰臟中溶菌酶活力隨著亞硝酸鹽脅迫時間的延長而逐漸升高，96 h達到最大值（0.62 U/ml）。墨吉明對蝦血清蛋白含量、肝胰臟SOD活力和溶菌酶活力在3個取樣時間點均存在顯著差異（P<0.05），而對照組在3個取樣時間點差異不顯著（P>0.05），而在3個取樣時間點對照組血清蛋白含量和2種酶的活力均未達到顯著差異（P>0.05）。[結論]墨吉明對蝦對亞硝酸鹽的安全濃度達到11.48 mg/L，證實該蝦類對亞硝酸鹽具有較高的耐受性。當水體中亞硝酸鹽濃度超過安全濃度時，會導致墨吉明對蝦的死亡。

關鍵詞墨吉明對蝦；亞硝酸鹽；半致死濃度；免疫因子

中圖分類號S949文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）21-160-04

海洋甲殼動物免疫易受到多種環境因子（如溫度、鹽度、污染物等）的脅迫，其中亞硝酸鹽作為水生態系統中氮代謝的中間產物，是水產養殖環境中主要的污染物之一。亞硝酸鹽不僅能抑制對蝦的生長和代謝，而且會對機體內抗氧化酶活力、溶菌酶活力以及細胞呼吸爆發力等體液免疫因子產生嚴重影響。已有研究表明，亞硝酸鹽可以改變羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）肝胰臟中超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低斑節對蝦（Penaeus monodon）血藍蛋白攜氧能力，引起凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei ）體內溶菌酶、血清蛋白含量變化等。此外，亞硝酸鹽對其他水生動物的免疫因子也存在影響。例如，羅非魚（Tilapia）體內溶菌酶活力隨著亞硝酸鹽濃度的升高而降低；三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）的免疫因子隨著亞硝酸鹽濃度的升高均下降；中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）幼體隨著亞硝酸鹽濃度升高以及脅迫時間的延長，SOD活力呈現下降趨勢。因此，控制養殖水體中亞硝酸鹽濃度對增強對蝦免疫水平和提高存活率至關重要。

墨吉明對蝦（Fenneropenaeus merguiensis），俗稱大蝦、大明蝦，隸屬節肢動物門（Arthropoda）、甲殼綱（Crustacea）、對蝦屬（Penaeus），廣泛分布于我國廣東、廣西沿海地區，此外在菲律賓等地也有分布。隨著凡納濱對蝦養殖規模的擴大，病害發生、種質退化以及進口親蝦價格攀升等問題嚴重影響著對蝦養殖產業和產量，因此眾多水產工作者開始尋求可以替代凡納濱對蝦的品種。墨吉明對蝦作為本地品種，其抗病性較強、生長速度較快、價格較進口凡納濱對蝦低，因此備受業內人士的關注。目前，國內外對墨吉明對蝦的研究主要集中在性成熟與胚胎發育、年齡與增長、基因表達、資源調查等方面，而關于亞硝酸鹽脅迫對墨吉明對蝦毒性及免疫因子的影響的研究尚未見報道。因此，筆者采用靜水生物毒性試驗法研究了亞硝酸鹽對墨吉明對蝦的毒性作用，并且探究了高濃度亞硝酸鹽脅迫下墨吉明對蝦體內血清蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）和溶菌酶活力的變化情況，旨在揭示墨吉明對蝦適合生存的亞硝酸鹽濃度，為墨吉明對蝦的大規模健康養殖提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2014年7月在廣東海洋大學無脊椎動物工程中心進行，試驗所用墨吉明對蝦由廣東海洋大學水產學院自行繁育獲得，挑選體色正常、體質健壯的墨吉明對蝦進行試驗，其體長為（51.54±10.24）mm，腹節長為（29.14±8.05）mm。試驗容器采用經消毒的100 L塑料白桶。墨吉明對蝦暫養7 d，每天換水1/2，暫養期間連續充氣，每天投喂東騰顆粒3～4次，每次投喂量占對蝦體質量的30%～40%。試驗用水為經過消毒、曝曬后的海水，海水溫度為26～28 ℃，鹽度23‰。亞硝酸鹽濃度采用亞硝酸鈉（分析純）配制，購于廣東光華有限公司。

1.2亞硝酸鹽急性毒性試驗

亞硝酸鹽濃度根據毒性預試驗結果按等對數間距設置6個濃度梯度（33.20、52.79、8393、133.45、212.19、337.38 mg/L），同時設置對照組（亞硝酸鹽濃度<0.02 mg/L），每組均設置3個平行，各放入20尾墨吉明對蝦。試驗期間，每天換水1/2，且保持各組濃度不變，供給充足氧氣，不投喂餌料，觀察并記錄24、48、96 h對蝦死亡情況，及時清除死亡個體。

1.3免疫指標的測定

另外選取健康的20尾墨吉明對蝦，飼養在亞硝酸鹽濃度為144.99 mg/L的白桶中，分別在24、48、96 h各取3尾對蝦進行取樣。用消毒過的1 ml注射器從墨吉明對蝦心臟中抽取血液，并加入到預冷的抗凝劑中，血液與抗凝劑的體積比為1∶1，抗凝劑采用Gross等方法配制。將抽取血液8 000 r/min離心5 min后，取上清用于血清蛋白含量的測定。另外選取墨吉明對蝦肝胰臟，將其放入滅菌后的研磨器中，加入1 ml生理鹽水進行研磨，研磨后的勻漿液置于4 ℃條件下保存，用于SOD和溶菌酶活力的測定。

3.3亞硝酸鹽對墨吉明對蝦SOD活力的影響

超氧化物歧化酶是水生動物體內一種重要的抗氧化酶，在清除超氧化自由基O-2、防止機體氧化損傷、維持機體中氧自由基平衡等方面發揮重要作用。因此，水生動物體內SOD活力能夠較好反映機體的免疫能力。該試驗結果表明，亞硝酸鹽脅迫下墨吉明對蝦SOD活力顯著低于對照組，且差異達顯著水平（P<0.05）。對羅氏沼蝦和中華絨螯蟹的研究也發現，在亞硝酸鹽脅迫下SOD活力顯著降低（P<0.05），并低于對照組。該試驗結果表明，試驗組墨吉明對蝦SOD活力變化呈現一定規律性，即先下降后升高，這與黃翔鵠研究亞硝酸鹽脅迫下凡納濱對蝦SOD活力變化有所不同。產生的原因可能是亞硝酸鹽脅迫條件下，墨吉明對蝦呼吸爆發產生大量的活力氧自由基，短時間內抑制SOD活力，但隨著脅迫時間的延長，機體通過自身調節，SOD表達量增多，SOD活力增強，氧自由基被清除，機體產生較弱的抗氧化能力，因此48 h后SOD活力上升。墨吉明對蝦在亞硝酸鹽脅迫下，短時間內通過提高自身的SOD活力，增強機體的抗氧化能力；然而，凡納濱對蝦SOD活力顯著下降，并無短暫升高，導致亞硝酸鹽的耐受力低于墨吉明對蝦。

3.4亞硝酸鹽對墨吉明對蝦溶菌酶活力的影響

溶菌酶是廣泛存在于水生動物血清、吞噬細胞中的一種堿性蛋白，能夠對革蘭氏陽性菌起到破壞并消除的作用。因此，它在一定程度上能夠反映環境因素改變對水生動物免疫水平的影響。該試驗結果表明，在亞硝酸鹽脅迫下墨吉明對蝦溶菌酶活力逐漸上升，且48～96 h溶菌酶活力高于對照組。黃翔鵠和丁美麗等在對凡納濱對蝦、中國對蝦的研究中發現，隨著亞硝酸鹽脅迫時間的延長，溶菌酶活力顯著降低，與該試驗結果不同。墨吉明對蝦具有一定的耐受性，會調節自身相關的免疫機制，因此在亞硝酸鹽脅迫下逐漸出現上升趨勢，且趨勢變化顯著（P<0.05）。已有研究表明，亞硝酸鹽脅迫能夠降低凡納濱對蝦和羅氏沼蝦的免疫力，增加副溶血弧菌的易感性，造成對蝦死亡率增大。墨吉明對蝦溶菌酶活力會在亞硝酸鹽脅迫下升高，致使對蝦的抗病能力增強，降低致病菌的易感性，提高存活率。因此，墨吉明對蝦與其他品種對蝦相比具有更強的耐亞硝酸鹽能力。

綜上所述，亞硝酸鹽脅迫下墨吉明對蝦免疫因子的變化，反映了對蝦在不同時間段對亞硝酸鹽的響應，而其誘導機制則有待進一步研究。該試驗條件下，墨吉明對蝦各免疫因子水平會隨脅迫時間的延長而提高，增強對蝦抗亞硝酸鹽能力，因此與其他品種對蝦相比亞硝酸鹽的安全濃度較高。

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