miRNA參與調控皮膚創傷修復的發生發展

張奇 王琛

【摘要】人體皮膚缺陷的修復是一個高度協調的生理過程，涉及眾多因素參與，它們以協同的方式重建再生新的皮膚屏障功能。基因的誘導表達和基因抑制是這個再生過程中的一個關鍵組成部分。MicroRNAs（miRNAs）是一種長約19—22nt的非編碼RNA。通過互補或不完全互補的方式識別并結合靶基因，使靶基因mRNA裂解或抑制其蛋白翻譯，因而在轉錄后水平調節基因和（或）蛋白的表達。miRNAs在皮膚形態發生和調節血管生成中發揮著關鍵作用。人類增生性瘢痕和正常皮膚組織中存在明顯的miRNA差異性表達，這可能與增生性瘢痕的發生、發展及演化密切相關。皮膚傷口愈合的特定階段有特定的miRNAs表達，這些特定的miRNAs失調是慢性傷口愈合的關鍵。認識到傷口誘導的miRNAs在皮膚傷口愈合過程中的功能意義，這可能會帶來一個全新的傷口診斷和治療策略。

【關鍵詞】miRNA增生性瘢痕靶基因

【中圖分類號】R658【文獻標識碼】B【文章編號】1005-0019（2015）01-0035-01

人體皮膚缺陷的修復是一個高度協調的生理過程，傷口愈合過程中有很多因素短期內以協同的方式重建新的皮膚屏障功能。基因的誘導表達和抑制是再生過程中的一個關鍵組成部分[1]。分子生物學的中心法則是，DNA信息的復制和RNA轉錄編碼的mRNA的生成。mRNA加工從核胞到胞漿基本上包括拼接和易位兩個部分，然后mRNA攜帶編碼信息進入核糖體。在核糖體內將代碼翻譯從而促進蛋白質的合成。在正確的時間段里合成特定的蛋白質并發揮它們的功能是治療傷口愈合的核心。并不是所有RNAs攜帶的密碼子都能夠合成蛋白質，非編碼RNA（ncRNA）基因產生的是具有其他功能RNA分子，而不是用于編碼蛋白質。NcRNAs僅要求高度特異的核酸識別而不需要很復雜的催化，所以它的作用很廣泛，比如其參與轉錄后基因表達的調控或指導RNA的修改。雖然一直普遍認為，大多數基因信息轉錄的結果為蛋白質，然而最近的證據表明，大多數哺乳動物和其他復雜有機體的基因組事實上是轉錄成ncRNA，其中許多是選擇性拼接和/或加工成更小的產品[2]。這些RNA（包括那些來自于內含子）似乎包含有一個內部信號隱藏層，會在不同生理和發展階段控制不同基因的表達水平，包括染色質結構/表觀遺傳記憶，轉錄，RNA拼接、編輯、翻譯。這個隱藏的內部信號具有非常重要的意義，對它考慮的不全面會直接影響我們從分子水平理解健康和疾病的能力。在生命的所有形式里，ncRNA包括核糖體RNA（rRNA），轉移RNA（tRNA）、小核RNA（snRNA），核仁小RNA（snoRNA），干擾RNA（RNAi），短干擾RNA（siRNA），和微小RNA（miRNA）。這篇文章的目的是關注miRNA在皮膚傷口愈合的潛在作用，以及在這個新領域研究miRNA的非凡意義。

miRNA是一種長約19—22nt的非編碼RNA，屬于短ncRNA家族[3]。它是由RNA多聚酶Ⅱ催化轉錄生成初始的miRNA，經Dice酶剪切成雙鏈miRNA，其中的一條單鏈可以選擇性結合到RNA誘導的沉默復合體，通過互補或不完全互補的方式識別并結合靶基因，使靶基因mRNA裂解或抑制其蛋白翻譯，因而在轉錄后水平調節基因和（或）蛋白的表達[4]（圖1）。一個miRNA可以調控多個基因，一個基因可以接受多個miRNAs調節，在一個特定的組織里有特定miRNA調節特定的mRNA集合，miRNAs在發育生物學、細胞和組織中的分布中起著重要的作用[5]。在人類共有640個miRNAs被發現，其他物種的miRNA被發現的更多，這些都記錄在miRNA的注冊表里。這些RNA成員在不同物種之間是高度保守的，正因如此，他們就成為了在基因組中識別新的miRNAs的工具[6]。

在基因組中，miRNAs分布在DNA的非編碼區域。他們可以存在于蛋白質編碼基因的內含子，或者ncRNA基因的內含子和外顯子區域[7]。因此，miRNA是在宿主基因的轉錄調控之后發揮作用。這些miRNAs或者是孤立存在，或者集群出現在一起[8]。miRNA失調后引起疾病的發生可能有以下四種可能：（1）miRNA可能會基因突變造成某種功能喪失；（2）miRNA基因突變導致某種功能增強；（3）靶點獲得突變不再能夠與miRNA結合；（4）基因可能獲得一個新的miRNA靶序列，導致沉默。這些可能存在的機制仍然需要在生物實驗中得到充分的驗證。例如，miRNA靶位點的突變與某些遺傳疾病間有著因果關系。此外，蛋白質參與miRNA的生物合成可能會引起某些疾病的發生。

Fig.1miRNA生成略圖：細胞核內由RNA多聚酶Ⅱ催化轉錄生成初始的miRNA（Pri-miRNA）.核酸內切酶Drosha及其輔助因子DGC48剪切pri-miRNA生成前體miRNA，長約70核苷酸（nt）。通過Exportin5運輸到細胞質，再次被第二個RNA酶Dicer剪切，形成長度大約20-22nt的成熟miRNA。其中的一條單鏈可以選擇性地結合到RNA誘導的沉默復合體，以互補的方式識別并結合靶基因的3末端，這樣引起靶基因mRNA裂解或抑制其翻譯過程。

目前，miRNA在皮膚傷口愈合的意義尚未明了。在這一部分中，文獻直接地探索了miRNAs在創面內血管生成中的作用，突出強調在傷口血管生成的環境中miRNAs的潛在意義。Dicer基因是從胚胎形成的第11天開始顯著表達，并持續保持17天不變，均勻地表達于整個胚胎組織[9]。為了進一步明確體內Dicer在傷口愈合過程中的功能，該dicerex1/2突變小鼠模型已經開發。這些突變小鼠缺乏Dicer酶的1和2外顯子，這些外顯子對于編碼蛋白質的成熟的miRNA的功能是必不可少的。純合子突變小鼠是不可行的；因此實驗前要進行胚胎檢查以排除純合子小鼠的可能。從胚胎第11.5天開始，與野生型或雜合子的胚胎相比幾乎所有的dicerex1/2突變小鼠的胚胎的生長和發育都是遲緩的。在這個階段的胚胎僅有壁薄的和發育欠佳的血管，這個實驗的可行性提供了miRNA參與血管生成的第一個證據。此外，對突變體胚胎卵黃囊的顯微鏡檢查顯示，與對照組相比，在dicerex1/2胚胎卵黃囊內有很少量的血管生成，并且這些血管很小，壁薄和缺少結締組織。這一實驗的結果讓我們明白Dicer酶在胚胎血管發育過程中是非常需要的。當對11.5天的胚胎卵黃囊進行抗PECAM抗體的內皮細胞染色，能夠發現模型的卵黃囊血管壁薄且排列混亂。突變體胚胎血管中出現的這一缺陷引發了對突變小鼠的血管生成基因的關鍵問題的思考。總而言之，用dicerex1/2突變小鼠模型研究提出了令人信服的證據，在體內干擾成熟miRNAs依賴的機制將不利于血管的生成（圖2）。盡管仍有許多問題亟待解決，比如解釋miRNA如何參與傷口愈合和相關的血管生成，但已令我們意識到沒有miRNA參與并發揮功能，皮膚傷口的愈合是不完全的。

Fig.2圖片內容來自Dicer酶敲除的小鼠模型。去除Dicer酶后成熟的miRNA形成障礙。在全部的基因敲除模型中，最異常的現象是胚胎血管受損，導致胚胎死亡。在皮膚的Dicer酶敲除的小鼠模型中，皮膚的形態發生受損進而導致新生小鼠的死亡。

以干擾RNA為基礎的治療是最近在生物醫學治療途徑中最熱門的方法[10]。它代表一個新的分支學科，具有重要的應用前景。能夠調節體內miRNAs的活性可能會對疾病治療和更多的機會在體內研究產生巨大的影響，目前有很多學者在向著這些方向研究。主要有兩種方法供選擇：使預期的miRNAs過表達或者沉默表達。前者，以dsRNA（像siRNA）的形式轉染人工合成的miRNA是可以的。對于mRNA的特定序列受到抑制即miRNA依賴的功能被抑制而導致的疾病，將寡核苷酸互補到成熟的miRNA或miRNA的前體可以使之無法綁定到靶基因mRNA的序列，幫助其重獲功能。成功設計的寡核苷酸應考慮到以下方面：如能成功轉染到體內，在組織中抗退化，具有特異性和與特定的miRNA有高度的親合力。這可以通過對核苷酸的化學修飾來完成，特別是進行2脫氧磷酸化修飾。目前這個方向的最新數據均來自體外研究，在體內的研究涉及組織miRNA的操縱，是受到限制的。

操縱miRNA的方法包括遺傳和非遺傳機制[11]。遺傳的方法包括（i）小鼠體內行miRNA基因敲除，（ii）蛋白編碼基因的miRNA靶位點的突變，和（iii）miRNA生成過程中缺失Dicer1酶導致成熟的miRNA生成缺陷。非遺傳的方法大致可分為兩類：反義寡核苷酸（ASO）[12]和基因拮抗[13]。經2-O脫氧磷酸化修飾的ASO是一個很有效工具用于沉默miRNAs如mir-122，腹腔內注射ASO足以實現預期的結果。在接受對照ASO治療的小鼠內看不到靶基因mRNA的變化表明mir-122受到了抑制。注射ASO的方法已經應用于肥胖小鼠的疾病模型中。喂食高脂肪食物共19周的C57Bl/6老鼠用mir-122的ASO注射治療。和對照組老鼠相比，敲除mir-122后導致血漿膽固醇水平降低35%[14]。

Fig.3總體設想miRNA在皮膚傷口愈合的意義。在健康受試者，傷口誘導特定的miRNA表達模式，這反過來又調節基因的表達產物，這種反應有利于傷口愈合，包括傷口血管生成，并最終成功的愈合。在患者，傷口誘導miRNA不同的表達模式，這種不利的反應改變了傷口誘導的基因表達產物，使愈合過程停滯導致慢性創面。

過表達的miRNA在體內的實驗研究也具有很大的重要性。轉基因小鼠的Northern印跡證實他們表達miR-1。Westernblot實驗顯示了與非轉基因的同窩小鼠相比，模型小鼠表達的Hand2蛋白水平顯著減少，然而Hand2的mRNA表達水平卻保持不變。這一結果確認Hand2是miR-1的一種靶蛋白，利用其前體使單個miRNA上調可以提高特定的蛋白質表達水平。

目前很多實驗研究確認在皮膚傷口愈合的特定階段涉及有特定miRNA的表達。為了識別miRNAs在瘢痕中的調節，Kazuya等首先使用miRNAs表達芯片對miRNAs在瘢痕和皮膚組織中的表達進行了綜合分析。與正常皮膚相比，總共有27個miRNAs在瘢痕中差異表達（未配對t檢驗，P<0.05）：其中，7種miRNAs是上調的，20種miRNAs是下調[15]。國內，劉英等實驗研究中miRNAs的表達譜芯片上miRNAs的總數是1200，代表了目前為止所有人類已知的miRNAs。其中，有32個miRNAs被最終確認。與相應的正常皮膚比較，23個上調miRNAs和9個下調的miRNAs在瘢痕組織中被確認為差異表達。miRNA-21在23個上調的miRNAs中表達量最高（6.87倍），和在9個下調的miRNAs中miRNA-203表達水平最低（-10.19倍）[16]。我們推測，這些特定miRNA的是傷口愈合過程中的關鍵物質，它們的失調是傷口不愈合而成為慢性傷口的主要原因（圖3）。如果推測結果屬實，這一假設可能會給慢性創面問題尤其是瘢痕問題的解決帶來新的診斷和治療策略。

參考文獻

[1]Branski，L.K.，etal.，Genetherapyinwoundhealing：presentstatusandfuturedirections.GeneTher，2007.14（1）：p.1-10.

[2]. Mattick，J.S.andI.V.Makunin，Non-codingRNA.HumMolGenet，2006.15SpecNo1：p.R17-29.

[3]. Bartel，D.P.，MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，andfunction.Cell，2004.116（2）：p.281-97.

[4]. Stadler，B.M.andH.Ruohola-Baker，SmallRNAs：keepingstemcellsinline.Cell，2008.132（4）：p.563-6.

[5]. Sood，P.，etal.，Cell-type-specificsignaturesofmicroRNAsontargetmRNAexpression.ProcNatlAcadSciUSA，2006.103（8）：p.2746-51.

[6]. Weber，M.J.，NewhumanandmousemicroRNAgenesfoundbyhomologysearch.FEBSJ，2005.272（1）：p.59-73.

[7]. Rodriguez，A.，etal.，IdentificationofmammalianmicroRNAhostgenesandtranscriptionunits.GenomeRes，2004.14（10A）：p.1902-10.