唐古特大黃水提取物對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈的舒張作用及機(jī)制

金晟 文龍旭 金范學(xué)

【摘要】目的觀察唐古特大黃水提取物的舒血管作用及其機(jī)制[方法]采用大鼠離體主動(dòng)脈環(huán)灌流模型，觀察唐古特大黃水提取物對(duì)苯腎上腺素預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)和去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張作用。應(yīng)用一氧化氮合成酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯和鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍(lán)研究唐古特大黃水提取物舒張血管作用的影響。[結(jié)果]唐古特大黃水提取物對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)具有非內(nèi)皮依賴(lài)性的舒張作用，分別用一氧化氮合成酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯和鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍(lán)預(yù)處理對(duì)唐古特大黃水提取物舒張作用沒(méi)有明顯影響。在無(wú)鈣緩沖液中，唐古特大黃水提取物對(duì)血管收縮有抑制作用。[結(jié)論]唐古特大黃水提取物對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用具有非內(nèi)皮依賴(lài)性，其機(jī)制與抑制血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存鈣的釋放有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】唐古特大黃；主動(dòng)脈，胸；血管舒張

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1005-0019（2015）01-0003-01

大黃是蓼科多年生宿根草本植物，我國(guó)主要分布于青海、甘肅等西北地區(qū)和四川、云南等西南地區(qū)[1]。2010年版《中國(guó)藥典》收載的大黃有3種即唐古特大黃（Rheum Tanguticum Maxim）、掌葉大黃（Rheum palmatum Linne）和藥用大黃（Rheum officinale Ball），其主要有效成分有大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素等。大黃味苦寒，具有瀉下通便、主下淤血、清熱解毒、調(diào)中和食、破瘀通經(jīng)等功效，其藥理作用主要有調(diào)節(jié)胃腸功能、抗心律失常、抗心肌缺血、降低血脂、降低血壓、抗病原微生物、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管、保肝及抗衰老等作用[2，3，4]。另有報(bào)道大黃素和大黃酚能舒張由腎上腺素和組胺誘導(dǎo)的豚鼠胸主動(dòng)脈；番瀉甙A和小劑量大黃素舒張兔主動(dòng)脈；沒(méi)食子酸（GA）通過(guò)抑制內(nèi)皮NO生成舒張血管，但對(duì)于唐古特大黃對(duì)離體血管舒張作用及機(jī)制，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)灌流模型，探討了唐古特大黃水提取物對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用及其作用機(jī)制。

1 材料

準(zhǔn)確稱(chēng)取唐古特大黃100g，加入蒸餾水1L，在80℃溫度煮沸3h，過(guò)濾減壓濃縮干燥而得10.57 g粉末。苯腎上腺素（phenylephrine， PE）、乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）、左旋硝基精氨酸甲酯（Nω-nitro-L-arginine methyl ester， L-NAME）和亞甲藍(lán)（methylene blue， MB）均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA）。其余試劑為市售分析純。本實(shí)驗(yàn)用Sprague-Dawley 大鼠，雄性，體重250-300g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。生理性營(yíng)養(yǎng)液成分（Krebs營(yíng)養(yǎng)液）（mmol.L-1）為NaCl 115.0、KCl 4.7、CaCl2 2.5、MgCl2 1.2、NaHCO3 25.0、KH2PO4 1.2和葡萄糖 10.0組成。pH值為7.4。SQG-4型四腔器官浴槽系統(tǒng)、HSS-1（B）型恒溫浴槽及RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)均為成都儀器廠產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的制作 腹腔注射給予大鼠3%戊巴比妥鈉50mg.kg-1麻醉大鼠后，打開(kāi)胸腔，分離胸主動(dòng)脈。將取下的胸主動(dòng)脈放入4℃的Krebs營(yíng)養(yǎng)液中，小心去除血管周?chē)闹炯敖Y(jié)締組織，把動(dòng)脈剪成4 mm寬的血管環(huán)，避免過(guò)度牽拉，以防損傷內(nèi)皮。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，去除血管內(nèi)皮時(shí)，使用小鑷子輕輕地磨擦血管環(huán)內(nèi)表面以去除內(nèi)皮細(xì)胞。將血管環(huán)懸掛于經(jīng)37 ℃預(yù)熱容量為20 mL Krebs營(yíng)養(yǎng)液的浴槽內(nèi)，一端固定，另一端通過(guò)張力換能器連接RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)。在持續(xù)通以95%O2和5%CO2混合氣體，將靜息張力逐漸調(diào)節(jié)至2.0g。在37 ℃下穩(wěn)定1h，期間每15min換液1次。

檢驗(yàn)血管內(nèi)皮活性：待動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定后，換液1次，浴槽中加入PE 1.0 μmol.L-1，收縮達(dá)峰值15min后，加入Ach 1.0 μmol.L-1，若加Ach后使PE預(yù)收縮的血管舒張60～90%，可認(rèn)為內(nèi)皮完整；反之，則認(rèn)為內(nèi)皮去除。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X±s）表示，并采用t檢驗(yàn)、ANOVA法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3 桂枝醇提取物對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用 取雄性大鼠40只，隨機(jī)分為5個(gè)組，即對(duì)照組、內(nèi)皮完整唐古特大黃水提取物大、小劑量組和去內(nèi)皮唐古特大黃水提取物大、小劑量組，每組各為8只。剖取各組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，加入1.0μmol.L-1苯腎上腺素，待血管環(huán)收縮穩(wěn)定后，分別向唐古特大黃水提取物大、小劑量組浴槽內(nèi)累計(jì)加入0.5，，2.0mg/ml唐古特大黃水提取物，向?qū)φ战M內(nèi)加入20mLKrebs營(yíng)養(yǎng)液，觀察血管環(huán)的舒張反應(yīng)，計(jì)算唐古特大黃水提取物各劑量組血管環(huán)的舒張百分比。舒張百分比=（苯腎上腺素作用后血管張力-唐古特大黃水提取物給藥后張力）/苯腎上腺素作用后血管張力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)皮完整+苯腎上腺素+唐古特大黃水提取物：大、小劑量組血管環(huán)舒張百分比為（6.23±5.44%）和（77.38±6.33%）；去內(nèi)皮+苯腎上腺素+唐古特大黃水提取物組：大、小劑量組血管環(huán)舒張百分比為（-3.94±17.18%）和（69.16±9.60%），兩者均對(duì)苯腎上腺素作用的胸主動(dòng)脈環(huán)舒張作用，但兩組相比較無(wú)顯著性差異（p>0.05）。

2.4 左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME）和亞甲藍(lán)（MB）預(yù)處理對(duì)唐古特大黃水提取物舒血管作用的影響 取雄性大鼠24只，隨機(jī)分為3個(gè)組，即對(duì)照組、L-NAME組和亞甲藍(lán)組，每組各為8只。剖取各組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)制作內(nèi)皮完整血管環(huán)，對(duì)照組用1.0μmol.L-1苯腎上腺素預(yù)處理，L-NAME組和亞甲藍(lán)組分別用0.01mmol/L L-NAME和10μmol.L-1 亞甲藍(lán)預(yù)處理，觀察2.0mg/ml唐古特大黃水提取物的舒張作用。結(jié)果顯示，對(duì)照組、L-NAME組和亞甲藍(lán)組舒張百分比分別為（77.38±6.33%）%，（68.65±6.83）%和（59.38±8.27）%，可見(jiàn)L-NAME和亞甲藍(lán)預(yù)處理對(duì)唐古特大黃水提取物的血管舒張作用均無(wú)明顯影響，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（p>0.05）。

2.5 唐古特大黃水提取物對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放作用的影響 取胸性大鼠16只，隨機(jī)分為對(duì)照組和唐古特大黃水提取物組。在無(wú)鈣環(huán)境下，對(duì)照組和唐古特大黃水提取物組的血管張力分別為0.55±0.06g和0.22±0.03g，兩者比較有顯著性差異（P<0.05），這提示著唐古特大黃水提取物舒血管作用與抑制細(xì)胞內(nèi)貯鈣的釋放有關(guān)。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大黃味苦寒，具有瀉下通便、主下淤血、清熱解毒、調(diào)中和食、破瘀通經(jīng)等功效，其藥理作用主要有調(diào)節(jié)胃腸功能、抗心律失常、抗心肌缺血、降低血脂、降低血壓、抗病原微生物、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管、保肝及抗衰老等作用[2，3，4]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以觀察到，唐古特大黃水提取物對(duì)苯腎上腺素（PE）引起的內(nèi)皮完整血管環(huán)和去內(nèi)皮血管環(huán)收縮均具有濃度依賴(lài)性舒張作用。苯腎上腺素誘導(dǎo)的血管收縮主要作用于a1腎上腺素受體，激活磷脂酶C，產(chǎn)生三磷酸肌醇，刺激平滑肌細(xì)胞內(nèi)貯鈣的釋放；也可通過(guò)激活細(xì)胞膜上的受體操縱性鈣通道和磷酸化電壓依賴(lài)性鈣通道使細(xì)胞外鈣內(nèi)流。本實(shí)驗(yàn)使用的提取物對(duì)苯腎上腺素預(yù)收縮的血管環(huán)舒張作用是內(nèi)皮非依賴(lài)性，故推測(cè)內(nèi)皮無(wú)關(guān)。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，血管內(nèi)皮分泌的血管舒張因子有：一氧化碳（NO），前列腺素（PGE）等；內(nèi)皮分泌的血管收縮因子有：內(nèi)皮素（ET），血栓素，血管緊張素Ⅱ（AGⅡ）。NO為血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的強(qiáng)效血管舒張因子，NO在內(nèi)皮NOS的作用下由左旋精氨酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，并通過(guò)激活平滑肌細(xì)胞sGC，增加環(huán)鳥(niǎo)苷酸含量而平滑肌舒張。后者主要通過(guò)cGMP依賴(lài)性蛋白激酶使鈣內(nèi)流減少，增加鈣ATP酶對(duì)鈣的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化而使血管舒張。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，用NOS抑制劑L-NAME或cGMP抑制劑MB預(yù)處理，沒(méi)有影響唐古特大黃水提取物舒血管作用，說(shuō)明和內(nèi)皮源性的舒張因子NO無(wú)關(guān)，提示可能直接作用于血管平滑肌而使血管舒張。笨腎上腺素通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和細(xì)胞外鈣內(nèi)流而引起血管收縮[2]。血管環(huán)在無(wú)鈣營(yíng)養(yǎng)液（含EGTA）環(huán)境下，笨腎上腺素的收縮是通過(guò)磷酸肌醇途徑，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存的鈣釋放所引起。本實(shí)驗(yàn)觀察到，在細(xì)胞內(nèi)無(wú)鈣環(huán)境下，唐古特大黃水提取物預(yù)處理抑制了苯腎上腺素（PE）所引起的血管張力。因此，唐古特大黃水提取物舒張血管是可能與抑制血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存的鈣釋放有關(guān)，但這還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，唐古特大黃水提取物對(duì)血管舒張作用是非內(nèi)皮濃度依賴(lài)性，其舒張機(jī)制可能與抑制血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存的鈣釋放有關(guān)。關(guān)于唐古特大黃水提取物中哪些有效成分參與了血管的舒張作用，尚有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)植物志編委會(huì).中國(guó)植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1998.[2]中國(guó)藥典[S].一部.2010.

[2]寇壬花.大黃治療心血管疾病的藥理學(xué)研究淺識(shí)[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21（10）：1692.

[3]南海江，許旭東，陳士林等.大黃屬植物研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2009，21（4）：690-701.

[4]郭志偉，劉琳娜.大黃及其有效成分的藥理研究概況[J].中國(guó)藥房，2006，17（22）：1741-1742.