七氟醚預處理對老齡大鼠術后認知功能障礙的影響及海馬區炎性細胞因子含量在其中的作用

常玉林　于麗麗　楊　強

（滄州市中心醫院麻醉科，河北 滄州 061000）

七氟醚預處理對老齡大鼠術后認知功能障礙的影響及海馬區炎性細胞因子含量在其中的作用

常玉林于麗麗楊強

（滄州市中心醫院麻醉科，河北 滄州 061000）

目的 評價七氟醚預處理對老齡大鼠術后認知功能障礙的影響及海馬區炎性細胞因子含量在其中的作用。方法 健康成年雄性SD大鼠138只，18個月齡，體質量400～450 g，采用隨機數字表法，將其分為3組（n=46）。對照組（C組）：僅戊巴比妥鈉麻醉，不進行手術；手術組（O組）：戊巴比妥鈉麻醉后行剖腹探查術，手術時間30min；七氟醚預處理組（Sev組）：吸入2.4%七氟醚30min，然后吸入空氣30min后處理同O組。于術前30min及術后第1、3、5、7 天時，行Morris水迷宮實驗，記錄逃避潛伏期、平臺象限停留時間和穿越原平臺次數；于術前30min及術后第1、7天時，取海馬組織，采用ELISA法測定海馬組織TNF-α、IL-1β及IL-6含量；采用流式細胞術測定海馬神經元凋亡率、胞質鈣離子濃度（［Ca2+］i），并于術畢即刻，采集動脈血樣，行血氣分析及記錄體溫。結果 與C組比較，O組術后各時點和Sev組術后第1、3、5天時逃避潛伏期延長、平臺象限停留時間縮短和穿越原平臺次數減少，O組術后第1、7天和Sev組術后第1天時海馬TNF-α、IL-1β及IL-6含量升高，海馬神經元凋亡率、胞質鈣離子濃度（［Ca2+］i）升高（P＜0.05）；與O組比較，Sev組術后各時點逃避潛伏期縮短、平臺象限停留時間延長和穿越原平臺次數增多，海馬TNF-α、IL-1β及IL-6含量降低，海馬神經元凋亡率、胞質鈣離子濃度（［Ca2+］i）降低（P＜0.05）。結論 2.4%七氟醚預處理可減輕老齡大鼠術后認知功能障礙，其機制與降低海馬區TNF-α、IL-1β及IL-6含量有關。

七氟醚；腦；術后認知功能障礙；老年人；白細胞介素類

術后認知功能障礙（POCD）是老年患者術后常見并發癥，可影響其預后。本課題組前期研究表明七氟醚預處理可降低老齡大鼠術后認知功能障礙［1］，而其機制目前仍不明確。大腦海馬神經元作為與學習記憶有關神經元，其發生炎性反應與POCD有密切聯系［2］。本研究擬評價七氟醚預處理對老齡大鼠術后認知功能障礙的影響及海馬區炎性因子含量在其中的作用，以探討其降低術后認知功能障礙的機制，為臨床相關研究提供參考。

1　材料與方法

1.1一般資料：健康成年雄性SD大鼠138只，18個月齡，體質量400～450 g，購自河北醫科大學實驗動物中心，安靜環境飼養，自由攝食和飲水。采用隨機數字表法，將其分為3組（n=46）：對照組（C組）、手術組（O組）和七氟醚預處理組（Sev組）。

O組腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，參照文獻［3-4］介紹的方法，腹部備皮、消毒，經腹部正中切口3cm、用鑷子鈍性分離肌肉顯露腹膜、解剖剪剪開腹膜暴露腹腔，應用探查針依次探查肝臟、脾臟、胃、小腸及大腸，手術時間共30min，縫合傷口，粘貼透氣防水傷口貼膜，腹腔注射16 U/kg青霉素；C組僅腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg，不進行手術；Sev組將大鼠置于有機玻璃麻醉箱內，以純氧為載體氣體，進氣端連接Vapor 2000七氟醚揮發罐（Dr?ger 公司，德國），出氣端連接5350型麻醉氣體監測儀（Datex-Ohmeda 公司，美國），維持七氟醚（批號：OX27，MaruishiPharmaceutical公司，日本）濃度為2.4%，箱底部鋪設少量鈉石灰吸收二氧化碳，維持二氧化碳濃度＜0.5%，持續30min后吸入空氣，吸入空氣30min后處理同O組。

1.2水迷宮實驗：隨機取10只大鼠，于術前30min、術后第1、3、5、7天時行Morris水迷宮實驗：首先進行定位航行實驗，將大鼠面向池壁從不同象限放入池中，大鼠從入水到找到平臺所需的時間為逃避潛伏期，每次實驗以60 s為限，如果60 s內未找到平臺，則引導大鼠到平臺上停留15 s，成績記為60 s。實驗前訓練4 d，實驗時每天測定2次，取2次逃避潛伏期的平均值作為當天成績?？臻g探索實驗：訓練結束后1 d，撤去平臺，將大鼠從同一象限面向池壁放入池中，記錄原平臺象限停留時間及穿越原平臺次數。

于術前30min及術后1、7 d時，隨機取10只大鼠，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后處死，取海馬組織，采用流式細胞術測定海馬神經元凋亡率，胞質Ca2+離子濃度（［Ca2+］i）；采用ELISA法測定TNF-α、IL-1β 及 IL-6濃度，并計算其海馬中含量。

稱取海馬組織100 mg左右置于200目銅網上剪碎并用鑷子輕搓過濾，紗網過濾，濾液1000轉/min（離心半徑10cm）離心5min，棄上清，加入500μL buffer緩沖液制備濃度為1×106/L單細胞懸液，磷脂結合蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）/聯合碘化丙錠（PI）標記，避光孵育5min，應用Epics2XLⅡ型流式細胞儀（Beckman Coulter 公司，美國）測定熒光強度分析細胞凋亡率。

稱取海馬組織100 mg左右置于200目銅網上剪碎并用鑷子輕搓過濾，紗網過濾，濾液1000轉/分（離心半徑10cm）離心5min，棄上清，加入3mL DMEM培養基制備濃度為1×106/L單細胞懸液，加入鈣離子熒光探針（Fura-3，AM）終濃度5 μmol/L，3μL，37 ℃恒溫負載30min，DMEM清洗2次，DMEM液懸浮，37 ℃負載15min，采用流式細胞儀測定熒光強度，Fura-3，AM的激發波長為488nm，發射波長為525nm，以熒光指數反映胞質鈣離子濃度。

稱取海馬組織30 mg左右，加入預冷生理鹽水制成10%海馬組織勻漿，4 ℃下3000轉/min （離心半徑10cm）離心10min，取上清液，采用ELISA法測定TNF-α、IL-1β 及 IL-6濃度，并計算其海馬中含量。

1.3血氣及體溫測定：隨機取6只大鼠，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，對大鼠左心室處皮膚備皮、消毒，采用小兒一次性靜脈輸液留置針于大鼠左心室處穿刺并置管以用來采集動脈血樣，于術畢即刻，采集動脈血樣，采用ABL80型血氣分析儀行血氣分析，并記錄體溫。

1.4統計方法：采用SPSS13.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用重復測量設計方差分析和單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結 果

2.1與術前30min時比較，O組術后各時點逃避潛伏期延長、平臺象限停留時間縮短和穿越原平臺次數減少，術后第1、7天時海馬TNF-α、IL-1β及IL-6含量，海馬神經元凋亡率、胞質鈣離子濃度（［Ca2+］i）降低升高（P＜0.05），Sev組術后第1、3、5天時逃避潛伏期延長、平臺象限停留時間縮短和穿越原平臺次數減少，術后第1天時海馬TNF-α、IL-1β及IL-6含量，海馬神經元凋亡率、胞質鈣離子濃度（［Ca2+］i）降低升高（P＜0.05）。見表1～3。

2.2與C組比較，O組術后各時點逃避潛伏期延長、平臺象限停留時間縮短和穿越原平臺次數減少，術后第1、7 天時海馬TNF-α、IL-1β及IL-6含量，海馬神經元凋亡率、胞質鈣離子濃度（［Ca2+］i）升高（P＜0.05），Sev組術后第1、3、5 天時逃避潛伏期延長、平臺象限停留時間縮短和穿越原平臺次數減少，術后第1 天時海馬TNF-α、IL-1β及IL-6含量，海馬神經元凋亡率、胞質鈣離子濃度（［Ca2+］i）升高（P＜0.05）。見表1～3。

2.3與O組比較，Sev組術后逃避潛伏期縮短、平臺象限停留時間延長和穿越原平臺次數增多，海馬TNF-α、IL-1β及IL-6含量，海馬神經元凋亡率、胞質鈣離子濃度（［Ca2+］i）降低（P＜0.05）。見表1～3。3組大鼠術畢時血氣分析各指標和體溫均在正常范圍內，組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

3　討 論

研究表明，吸入2.4%七氟醚預處理30min或1 h可改善局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠空間學習記憶能力［5-6］，且1 MAC七氟醚為臨床常用濃度，大鼠七氟醚1 MAC濃度大約為2.4%，所以本研究七氟醚的濃度選擇2.4%。參照預實驗及血氣結果，本研究采用七氟醚對老齡大鼠預處理30min，保證大鼠處于麻醉狀態且不至于死亡，吸入空氣30min可保證大鼠完全蘇醒且狀態恢復至吸七氟醚前。

Morris水迷宮實驗是評價嚙類動物空間學習記憶功能的經典方法，其可反映動物獲取空間信息記憶能力和記憶存儲能力［7］。Morris水迷宮實驗結果表明，與術前30min時比較，O組術后各時點逃避潛伏期延長，平臺象限停留時間縮短，穿越原平臺象限次數減少，提示POCD模型制備成功。

研究表明手術創傷誘發海馬區促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6表達上調與術后認知功能障礙有著密切的聯系［8-9］。所以本研究炎性因子指標選擇為TNF-α、IL-1β 及 IL-6。ELISA為動物實驗及臨床試驗中測定炎性細胞因子經典方法。所以本研究結合水迷宮實驗結果，采用ELISA法于術前30min及術后第1、7天測定海馬TNF-α、IL-1β及IL-6含量。

本研究結果表明，與O組比較，Sev組術后各時點逃避潛伏期縮短，平臺象限停留時間延長，穿越原平臺象限次數增多，術后第1、7天時海馬TNF-α、IL-1β及IL-6含量降低，提示七氟醚預處理可能通過降低海馬區TNF-α、IL-1β及IL-6含量，改善老齡大鼠術后認知功能。其具體機制目前仍不明確。研究表明，七氟醚預處理可抑制NF-kappa B、 p38 MAPK的活化及下游促炎性信號傳導級聯反應，降低炎性細胞因子表達，減少局灶性缺血再灌注大鼠腦缺血面積［10］。本研究七氟醚預處理可能通過上述機制降低大鼠海馬區TNF-α、IL-1β及IL-6含量，減少上述細胞炎性因子引起的神經毒性物質釋放，降低海馬神經元胞質鈣離子濃度降低神經元凋亡率，減輕其對海馬神經元的損傷，改善老齡大鼠術后認知功能。

綜上所述，2.4%七氟醚預處理可減輕老齡大鼠術后認知功能障礙，其機制與降低海馬區TNF-α、IL-1β及IL-6含量有關。

表1　三組大鼠不同時點Morris水迷宮實驗結果的比較

表1　三組大鼠不同時點Morris水迷宮實驗結果的比較

注：與術前30min時比較，aP＜0.05 與C組比較，bP＜0.05 與O組比較，cP＜0.05

組別逃避潛伏期（s）術前30min術后1 d術后3 d術后5 d術后7 d C組23.6±2.424.4±2.125.5±2.323.6±2.123.3±2.2 O組24.5±2.165.4±6.5ab57.5±5.4ab42.6±4.0ab32.4±3.4abSev組23.3±2.043.6±5.1abc33.3±4.5abc31.0±3.0abc26.4±2.4c組別原平臺象限停留時間（s）術前30min術后1 d術后3 d術后5 d術后7 d C組51±454±655±455±556±5 O組53±522±3ab26±5ab30±6ab35±5abSev組55±535±5abc36±4abc46±6abc55±6c組別穿越原平臺次數（次）術前30min術后1 d術后3 d術后5 d術后7 d C組15.6±4.015.2±3.516.0±2.615.5±2.716.5±3.5 O組15.5±3.34.1±1.6ab5.5±2.0ab9.5±2.5ab11.6±2.6abSev組15.4±4.67.5±1.8abc9.5±2.1abc13.1±2.6abc15.5±3.3c

表2　三組大鼠不同時點海馬IL-1β 、TNF-α及 IL-6含量的比較

表2　三組大鼠不同時點海馬IL-1β 、TNF-α及 IL-6含量的比較

注：與術前30min時比較，aP＜0.05 與C組比較，bP＜0.05 與O組比較，cP＜0.05

指標組別術前30min術后第1天術后第7天IL-1β（pg/mg）C組35.3±2.636.0±2.735.7±3.0 O組34.5±2.5128.4±6.3ab80.6±5.6abSev組35.5±2.771.7±5.5abc37.7±4.0cTNF-α（pg/mg）C組45.0±2.643.6±2.447.1±3.0 O組46.5±2.7130.4±8.7ab90.0±5.3abSev組45.0±2.684.5±6.2abc50.1±3.5cIL-6（pg/mg）C組33.2±2.135.3±2.430.3±2.0 O組34.2±2.7107.2±5.1ab85.0±4.8abSev組33.6±2.572.6±3.5abc35.8±3.0c

表3　三組大鼠不同時點海馬神經元凋亡率和神經元胞質［Ca2+］i的比較（

表3　三組大鼠不同時點海馬神經元凋亡率和神經元胞質［Ca2+］i的比較（

注：與術前30min時相比，aP＜0.05 與C組相比，bP＜0.05 與O組相比，cP＜0.05

2+組別海馬神經元凋亡率（%）海馬神經元胞質［Ca］i術前 30min術后第1天術后第7 天術前 30min術后第1天術后第7天C組3.6±2.04.1±3.03.8±2.64.5±1.65.1±2.55.0±2.3 O組4.0±2.817.2±4.5ab7.3±3.5ab4.6±1.818.4±5.5ab9.5±2.5abSev組3.7±2.59.5±3.8abc4.1±3.0c5.0±2.110.3±3.5abc4.5±1.5c

表4　三組大鼠術畢時血氣分析結果和體溫的比較

表4　三組大鼠術畢時血氣分析結果和體溫的比較

組別 pHPaCO2（mm Hg） PaO2（mm Hg） SaO2（%）Body temperature（ ℃）C組7.43±0.0436.5±2.897±1298±1.637.1±0.3 O組7.45±0.0637.7±2.687±597±1.537.2±0.4 Sev組7.39±0.0535.8±2.594±696±1.536.9±0.3

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Effects of Preconditioning with Sevoflurane Inhalation on Postoperative Cognition Disorders of Aged Rats and the Role of Inflammatory Factor Levels in the Hippocampus

CHANG YU-lin， YU Li-li， YANG Qiang
（ Department of Anesthesiology， Cangzhou Central Hospital， Cangzhou 061000， China）

Objective To investigate the effects of preconditioning with sevoflurane inhalation on postoperative cognition disorders of aged rats and the role of inflammatory factor levels in the hippocampus. Methods One hundred and thirty-eight healthy male SD rats， aged 18 months，weighing 400-450 g were randomly devided into 3 groups （n=46 each）. Control group （group C） were only anesthetized with pentobarbital and not underwent operation； operation group （group O） were anesthetized with pentobarbital and underwent 30min of exploratory laparotomy； sevoflurane preconditioning group （group Sev） were inhaled 2.4% sevoflurane 30min，then treat like group O following by inhaled room air 30min. The escape latency， the time of staying at the original platform quadrant and frequency of crossing the original platform was assessed using Morris water maze on 30min before operation and 1st， 3rd， 5th， 7th days after operation. The brain tissues were taken for detecting the levels of inflammatory factor，the apoptotic rate and intracellular ［Ca2+］iof hippocampal neuronal at 30min before operation and 1st， 7th days after operation. And immediately after surgery arterial blood samples were taken for blood gas analysis， at the same time points body temperature was recorded. Results Compared with group C， the escape latency was prolonged， the time of staying at the original platform quadrant and frequency of crossing the original platform were decreased at all time points in group O and at the 1st， 3rd， 5th day after operation in group Sev； the levels of TNF-α，IL-1β，IL-6 of the hippocampus and the apoptotic rate and intracellular ［Ca2+］iof hippocampal neuronal were increased at the 1st， 7th day after operation in group O and at the 1st day in group Sev（P＜0.05）， compared with group O， the escape latency was shorten， the time of staying at the original platform quadrant and frequency of crossing the original platform were increased， the levels of TNF-α， IL-1β， IL-6 and the apoptotic rate and intracellular ［Ca2+］iof hippocampal neuronal were decreased at all time points after operation in group Sev（P＜0.05）. Conclusion Sevoflurane preconditioning can improve postoperative cognitive function of aged rats， which may be related to decrease the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 and regulation of imbalance of calcium homeostasis and reduction the apoptotic rate of hippocampal neuronal.

Sevoflurane； Brain； Postoperative cognitive dysfunction； Aged； Interleukins

R614

B

1671-8194（2015）09-0001-03

2013年河北省滄州市科技計劃項目（項目編號）131302122

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