重組釀酒酵母磷酸膽堿胞苷轉移酶（CCT酶）基因的工程菌穩定性研究

李曉丹　夏冰　汪仁

摘要：為了進一步研究基因工程菌E.coli B121（DE3）/pET-29a-cct在培養基中傳代50次過程中菌種的穩定性，通過將菌體和菌落的形態、質粒的穩定性、質粒酶切圖譜和重組CCT酶的表達量及活性作為指標進行考察，來評價該工程菌的穩定性。結果顯示，重組CCT酶基因的工程菌在轉接50次的過程中質粒穩定性高，其保有率為90%，表達產物可達發酵液總蛋白的15%以上。該菌在第50代后仍具有轉化活性，說明工程菌轉化活性穩定。

關鍵詞：磷酸膽堿胞苷轉移酶（ccT酶）；質粒穩定性；工程菌穩定性；轉化活性

中圖分類號：Q939.9 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0049-02

大腸桿菌遺傳背景清楚，生長迅速，發酵周期短，是基因工程的主要受體菌，已得到廣泛應用。然而，克隆有外源基因的重組質粒轉化到大腸桿菌細胞之后，會產生一系列的負面生理效應，從而影響其穩定性。外源基因表達后，增加了細胞的代謝負擔，質粒穩定性會下降。一般來說，丟失質粒的細胞往往比含有質粒的細胞具有更高的生長速率。基因工程菌的質粒不穩定現象在生產實踐中普遍存在，這導致對它的應用受到一定的限制。通常質粒穩定性的高低是影響發酵產量的重要因素，質粒丟失會導致所表達的蛋白產量下降，進而影響發酵產物的收率，還可能造成較大的經濟損失。

磷酸膽堿胞苷轉移酶（CCT酶）可直接催化胞苷三磷酸（CTP）和磷酸膽堿合成胞二磷膽堿。在之前的研究中，本課題組已克隆到釀酒酵母磷酸膽堿胞苷轉移酶基因（cct）并插入表達載體pET29a（+）中，成功構建了重組工程菌E.coliBL21（DE 3）/pET-29a-cct，獲得了具有催化活性的工程菌株。該工程菌株具有較好的工業應用前景，為確保生產中菌種的穩定性，進一步對該重組工程菌的穩定性進行研究具有相當重要的實際意義。

1.材料與方法

1.1材料和培養基

重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET-29a-cct由江蘇省中國科學院植物研究所分子實驗室構建。除發酵培養基外，使用的皆為LB培養基，發酵培養基配方：Na2HPO4·12H2O24.0g，KH2PO4 4.9g，NaCl0.5g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCl20.1g，酵母粉5.0g，蛋白胨5.0g，pH值調至7.2，121℃滅菌20min.

1.2方法

1.2.1菌種的傳代將保存于-80℃冰箱中的原始菌株大腸桿菌BL21（DE3）/pET-29a-cct劃線于含卡那霉素（50ug/mL）的LB固體培養基上，再挑取單菌落接種于液體培養基中，37℃振蕩過夜。按1%接種量將過夜培養物轉接于不含抗生素的lJH液體培養基中，37℃培養12h，每轉接1次計傳代1次，共轉接50次。分別取第10、20、30、40、50次的轉接培養物500uL，加入甘油（終濃度為30%），保存于-80℃冰箱中，備用。

1.2.2工程菌形態的觀察取樣后菌體用生理鹽水洗滌3次后，再用少量的生理鹽水懸浮。制片并進行革蘭氏染色，于光學顯微鏡下觀察。

1.2.3平板稀釋計數法將連續搖瓶培養試驗轉接的第10、20、30、40、50代取樣進行平板稀釋檢測質粒的缺失程度。檢測時，取菌液1mL用無菌水逐級稀釋，取3個合適的梯度，分別涂在固體選擇性培養基和非選擇性培養基平板上，每個處理3次重復。倒置在37℃培養箱中培養過夜，計算培養皿中的菌落數，根據選擇性培養基中的菌落數與非選擇性培養基中菌落數的比值，即可計算出質粒的缺失率。

1.2.4質粒酶切圖譜的鑒定采用堿裂解方法從第10、20、30、40、50代菌體中提取質粒，0.75%瓊脂糖凝皎電泳檢測。為確定CCT酶編碼基因的穩定性，進一步將各代菌所提質粒用限制性內切酶Nde 和Xho I進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5重組CCT酶的表達穩定性及酶活鑒定取0、10、20、30、40、50代菌種，分別接種于液體lJH培養基中，37 qC振蕩過夜培養，轉接于新鮮的發酵培養基中，37℃培養3～5h，加入IPTG（終濃度為1mmol/L）30℃誘導表達10h，取1mL菌液，于12000r/min離心2min，收集菌體并重懸于500uL1×SDS加樣緩沖液，沸水浴中煮沸10min以充分裂解細胞，12000r/min室溫離心10min，使細胞碎片及DNA等沉淀，取適量溶液上樣，SDS-PAGE分析。粗酶液制備及酶活測定方法參照文獻[3]。

2.結果與分析

2.1工程菌形態

將取樣的各代菌體進行革蘭氏染色，光學顯微鏡下可見形態均勻一致的革蘭氏陰性短桿菌，劃線培養未見雜菌生長，菌體和菌落的形態均正常。

2.2種子液選擇壓力對質粒穩定性的影響

通過添加抗生素可選擇性使得只有那些保留相應質粒的細胞才能夠生長，采取施加選擇壓力可以用來消除重組質粒的分配性不穩定。在種子培養基中分別添加終濃度為0、10、20、50ug/mL卡那霉素，37℃振蕩培養24h后，采用平板稀釋計數法考察工程菌質粒的缺失情況，結果見表1。

從表1中可以看出，當種子培養基中沒有添加抗生素時，質粒有一定程度的丟失，當卡那霉素濃度大于20ug/mL時，質粒保有率為100%。

2.3重組質粒的穩定性

在無選擇壓力的培養條件下，若重組菌丟失質粒，由于其沒有額外的代謝負擔，隨著傳代次數的增加最終可取代帶有質粒的工程菌，從而導致發酵失敗，因此還需檢測在無選擇壓力的培養基中工程菌中重組質粒的穩定性。

試驗結果表明，經傳代10次后，工程菌中的質粒保有率為100%，20代后工程菌中質粒的保有率開始下降，第20代為98%，第30代為95%，第40代為92%，50代后的菌種質粒保有率仍保持90%，表明工程菌在未加抗生素的培養基中傳代，重組質粒仍可以在工程菌中穩定存在。

由圖1可以看出，工程菌在傳代50次后仍帶有質粒，說明重組質粒在工程菌中穩定性較好。為確定CCT酶編碼基因在反復傳代后的穩定性，將從各代菌體中提取的質粒用限制性內切酶Ned I和Xho I雙酶切后，上樣，用O.75%瓊脂糖凝膠電泳。由于原始質粒pET-29a-cct上CCT酶的編碼基因為1275bp，質粒pET29a（+）全長位5371bp，從圖2可見，在1.3kb和5.3kb）處各有1個條帶，這與理論值相符。質粒電泳和酶切驗證的結果表明：經傳代后的工程菌保留了原重組質粒，質粒骨架與重組基因的大小均未發生改變，說明工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-29a-cct人工傳代50次后，質粒仍穩定存在。

2.4CCT酶的表達及活性穩定性

電泳的結果（圖3）顯示，在50ku附近有1條帶，和CCT酶分子量理論值相符合，各代之間無明顯差異。電泳結果表明，工程菌在傳代50次的過程中，CCT酶的表達穩定，CCT酶的表達量占發酵液中總蛋白的15%以上。酶活檢測顯示工程菌粗酶液在第50代后仍具有活性，酶活為0.04U/mL，說明該工程菌的CCT酶活性穩定。

3.討論

在本實驗室成功構建獲得了具有磷酸膽堿胞苷轉移酶催化活性的基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-29a-cct后，為進一步了解該工程菌的穩定性，本研究通過多次傳代來考察該工程菌中重組質粒的穩定性，同時鑒定了該工程菌在反復傳代后外源蛋白的表達及其活性的穩定性。

質粒的不穩定性可分為2種——結構不穩定性和分裂不穩定性。在本研究采用的試驗方法和條件下，該基因工程菌在連續傳代50次后，提取質粒酶切驗證后證明外源基因片斷沒有丟失，說明該質粒具有結構穩定性；但是在無抗生素選擇壓力的培養條件下，傳代20代后開始出現質粒丟失的細胞，連續傳代50次后，約有90%的細胞含有正常質粒，該基因工程菌表現出一定的分裂不穩定性。為了保證該基因工程菌的正常生長及CCT酶的表達，在種子液中添加卡那霉素可以在一定程度上保證該基因工程菌的穩定性。因此該基因工程菌在質粒穩定性方面滿足工業化生產的要求，可以應用于擴大生產。

基因工程菌產業化應用的最大障礙在于保存及培養過程中表現出的傳代不穩定性。試驗結果表明，本實驗室構建的酵母磷酸膽堿胞苷轉移酶工程菌在傳代過程中的質粒未發生明顯丟失，也未發現質粒結構不穩定，而且傳至50代次岳仍保留重組質粒，并保持原代菌種的卡那霉素抗性、生物催化活性及其他生理特征，表明此工程菌適合于工業化生產。