2個淀粉含量不同木薯品種SSⅡ基因序列及不同生育期淀粉含量比較

曾文丹　羅興錄

摘要：以高淀粉木薯品種FX 01和低淀粉木薯品種sc 124為材料，探討可溶性淀粉合成酶基因SSⅡ序列以及在不同生育期其淀粉特性的差異。結果表明：在SSⅡ，，的編碼區發現了2個差異位點，這2個位點的突變導致了基因編碼的蛋白發生了改變，分別由谷氨酰胺變成精氨酸和亮氨酸變成苯丙氨酸。在淀粉積累的各個時期，高淀粉木薯品種FX 01的支鏈淀粉、直鏈淀粉、總淀粉含量均顯著高于低淀粉木薯品種SC124。

關鍵詞：木薯；可溶性淀粉合成酶；基因；淀粉

中圖分類號：S533.01 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0035-04

木薯（Manihot esculenta Crantz）別稱樹薯、木番薯，是一種富含淀粉的塊根作物，因而有“淀粉之王”“地下糧倉”等美稱，與馬鈴薯、甘薯并稱為世界三大薯類作物。近年來，由于全球環境、糧食、能源危機的不斷加劇，新興綠色能源產業越來越受到人們的重視。木薯作為清潔、可再生的新興生物質能源的代表，已成為中國綠色能源發展戰略的新焦點。木薯淀粉中直鏈淀粉約占17%，支鏈淀粉約占83%，而高比例的支鏈淀粉可轉變為變性淀粉，是生產加工的重要原料。因此如何提高木薯支鏈淀粉的含量是研究的主要目標之一。

已有研究表明，可溶性淀粉合成酶（SSS）在α-1，4-糖苷鍵的作用下，將ADPG中的葡萄糖加到側鏈的非還原端，使支鏈淀粉的分支鏈進一步延伸和加長，因此可溶性淀粉合成酶（sss）的主要作用是參與支鏈淀粉的合成?？扇苄缘矸酆铣擅富颍⊿SⅡ）負責中等長度支鏈淀粉的合成，該基因在淀粉構成中發揮著重要作用，是支鏈淀粉積累過程中的關鍵因子。本試驗中高淀粉木薯品種FX 0l是以低淀粉木薯品種SC 124為材料，經過輻射誘變而獲得的高淀粉突變體。2個品種之間除塊根淀粉含量有較大差異外，其他農藝性狀相似。本試驗探討高低木薯淀粉品種SSⅡ，基因序列和淀粉特性的差異，以期為木薯支鏈淀粉生物合成和分子調控的機理提供一定的理論依據。

1.材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為高淀粉木薯品種FX 01和低淀粉木薯品種SC 124，種植于廣西大學農學院科研教學基地。于2012年4月下種。2個品種設3次重復，隨機排列，田間管理與常規大田生產管理相同。

1.2取樣時間與方法

指標采樣時間于木薯塊根形成期（下種后120d）、塊根膨大期（下種岳180d）、塊根成熟期（下種岳240d）、收獲期（下種后300d）采樣。采集鮮樣后，105℃殺青30min左右，75℃烘干至恒質量后粉樣過篩。

1.3SSⅡ基因克隆

1.3.1RNA的提取參照參照潘華清等的異硫氰酸胍一過柱法略有修改。

1.3.2引物設計根據GenkBank中木薯SSⅡ，基因（登錄號為EF667961.1）序列，設計引物。SSⅡ上游引物（p1）：5一ATGGCATTTATAGGATCACTTCCT-3；SSⅡ下游引物（p2）：5‘-TCACCACTGGTACTTGGCTGCA-3。

1.3.3 RT-PCR擴增cDNA第一鏈的合成按照M-MLV逆轉錄酶的操作說明進行，引物使用隨機引物olig（dT）18；PCR反應體系：cDNA模板1uL、p1和p2各1uL、2×Gold-Star Best Master Mix 10uL、加RNase free的ddH2O至20uL；PCR反應程序：95℃預變性10min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s，35個循環；再在72℃下延伸10min。擴增產物加核苷染料后在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。用凝皎回收試劑盒回收目的條帶。

1.3.4 PCR擴增產物的連接及轉化

將回收的目的條帶與PUC-TA進行連接載體。連接體系：回收產物1uL、PUC-T載體1uL、Solution Buffer 5uL、ddHzO 3uL。將上述組分振蕩混勻，22℃連接2h。將上述連接產物加入到50uL的大腸桿菌DH50z感受態細胞中，隨機挑取菌液經鑒定后送上海生物工程有限公司測序。

1.4淀粉含量的測定

淀粉含量測定參照何照范的雙波長法。支鏈淀粉、直鏈淀粉含量測定的波長參照閔義等的方法，直鏈淀粉含量測定波長為570nm，參比波長為486nm；支鏈淀粉含量測定波長為532nm，參比波長為766nm。用UV-2501型紫外分光光度計測定吸光度。

1.5數據分析

采用SPSS 18.0和Excel 2003進行數據分析。

2.結果與分析

2.1總RNA的檢測

以木薯的葉、莖、根混合樣為材料提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳（圖1），檢測RNA的質量。本試驗提取的總RNA的28S、18S條帶清楚完整，無拖尾，且28s條帶亮度大約是18s條帶的2倍，點樣孔及附近無亮斑，表明RNA完整性好，無蛋白質和多糖等雜質污染。核酸蛋白檢測儀測定RNA的純度和濃度，D260nm/D280nm的平均值為1.87，濃度為3100ng/uL。數據表明所提取的RNA純度較高，能夠滿足后續試驗的要求。

2.2RT-PCR擴增產物的鑒定

以逆轉錄所得的cDNA為模板，加引物p1、p2進行PCR擴增。將擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，如圖2所示。PCR產物大小約為2 200bp，PCR產物大小與預期目的片段大小符合。

將擴增獲得的SSⅡ基因與T載體連接，并轉化到大腸桿菌DH5a感受態細胞中。從轉化后的平板隨機挑選單菌落震蕩培養3～4 h后進行菌液PCR檢測。如圖3、圖4所示菌液擴增片段大小為2200bp，與RT-PCR結果一致，表明為陽性克隆。將陽性菌液送往上海生物工程技術服務有限公司進行測序比對。

2.3 FX 01和SC 124中SSⅡ序列的差異分析

在引物和PCR條件不變的情況下，以cDNA為模板，進行PCR擴增。凝膠電泳結果顯示，從FX 01和SC 124中擴增的條帶大小相同，表明SSII在FX 01和sc 124中大小相同。通過測序分析，發現在SSII的編碼區存在2個位點差異，分別在+272和+1800處，其中+272處SC 124為A，而FX 01則突變為G；在+1800上，SC 124為G，而FX 01突變為T（圖5），這2個位點的突變導致了基因編碼的蛋白也發生了改變，分別由谷氨酰胺變成精氨酸、由亮氨酸變成苯丙氨酸（圖6），蛋白由極性變成非極性。

2.4木薯塊根淀粉含量的變化

FX 01和SC 124直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量的變化均是隨著生育期的推移而不斷增加（表1）。整個生育期內，FX 01塊根直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量均高于SC124。在木薯塊根形成期，高低木薯品種FX 01與SC 124塊根的直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量差異均不顯著，而在木薯的塊根快速膨大期、塊根成熟期及收獲期，FX 01塊根直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量均極顯著高于SC 124。

3.討論與結論

SS基因在支鏈淀粉合成中起著重要的作用，研究表明，如果SS基因發生突變或通過轉入反義SS基因，該基因的結構將發生改變，從而引起可溶性淀粉合成酶的活性降低，最終導致支鏈淀粉含量也隨之變化。譚彩霞等通過RNAi技術轉化馬鈴薯，其結果表明馬鈴薯中淀粉粒的結構和形態也隨之發生了改變，與此同時馬鈴薯中SSN基因的表達量減少，從而使SSS酶活性也受到影響，最終造成直鏈淀粉含量上升而支鏈淀粉含量卻迅速下降。對擬南芥SSIV突變體的研究發現其淀粉含量有所減少但支鏈淀粉和直鏈淀粉的比例并未發生變化，鏈長分布也未發生改變。王平榮等用EMS誘變獲得的突變體植株中，有3個突變體的OsDVR堿基突變位點和數目不同，從而導致編碼蛋白的氨基酸發生突變，造成了它們在葉綠素含量、葉綠素組成、植株表型以及主要農藝性狀和單株產量極顯著差異。

本試驗中，在SSⅡ的編碼區發現了2個位點差異，在+272上，SC 124為A，而FX 01則突變為G；在+1800上，SC124為G，而FX01突變為T，這2個位點的突變導致了密碼子發生改變從而導致其編碼的氨基酸發生變化，分別由谷氨酰胺變成精氨酸、由亮氨酸變成苯丙氨酸，最終導致蛋白由極性變成非極性。這可能是導致從塊根形成期到收獲期，高淀粉木薯品種FX 01的支鏈淀粉、直鏈淀粉、總淀粉含量均顯著高于低淀粉品種SCl24的原因之一。至于其他淀粉合成關鍵酶基因有何變化還有待進一步研究。