長期保存活力低下的大腸桿菌制備感受態細胞條件的優化

晏國洪　姜山

摘要：研究了CaCl2，溶液處理方法、長期保存的原始菌種活化次數、離心條件對感受態細胞最終轉化效率的影響，并分析其最佳轉化效率參數、優化感受態制備和轉化方法。結果發現：使用過濾處理的GaCl2比滅菌處理的CaCl2制備的感受態細胞轉化效率高。在其他條件相同的情況下，長期保存的大腸桿菌菌種活化3次以上的轉化率最高；制備感受態細胞第1次離心在4℃、4 000g條件下離心15min，第2次離心時在4℃、4000g條件下離心5min得到的感受態細胞轉化率最高。

關鍵詞：大腸桿菌；感受態細胞；轉化率；優化

中圖分類號：Q813.1+1 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0046-03

DH5α是一種常用于質粒克隆的菌種。感受態細胞的制備和轉化是分子生物學實驗室頻繁使用的一項重要的常規操作。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α在使用含NPTⅡ質粒載體轉化時，可用卡那霉素鑒別重組菌株。重組DNA轉化細菌技術的關鍵是通過物理或者化學的方法，人工誘導細菌細胞成為敏感的感受態細胞，這種細胞易接受外源DNA，但由于轉化是一個很復雜的過程，具體的作用機理尚不明確。一些優良的大腸桿菌菌種價格較貴或獲得途徑較難，而實驗室保存的大腸桿菌菌種一般時間較長（約5～10年），導致菌種部分死亡和活力降低，在實際操作中制得的感受態細胞轉化效率常常不能滿足試驗的要求。

對于大腸桿菌而言，外源DNA導入主要有電穿孔轉化法、MgCl2-DMSO法、Inoue法、CaCl2法等多種。電穿孔轉化法需要特殊的儀器設備，MgCl：-DMSO法和Inoue法操作比較復雜。而CaCl2轉化法操作相對簡單、方便，而且成本非常低廉，已成為實驗室進行基因克隆操作常用方法。CaCl2法制備感受態細胞的關鍵因素有CaCl2溶液的質量、大腸桿菌DH50z生理狀況、制備過程中的離心條件。本試驗用CaCl2法對保存了5.5年的菌種按以上3個關鍵因素設計試驗，優化感受態細胞的制備條件。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與質粒大腸桿菌DIlSa由貴陽醫學院寄生蟲實驗室贈送，pRll01-ON質粒購置于TaKaRa公司（圖1）。

1.1.2試劑LB培養基，卡那霉素素溶液，CaCl2溶液，均按文獻[10]的要求配制。

1.1.3儀器凝皎成像系統、電泳儀、超凈工作臺、冷凍離心機、搖床、紫外分光光度計。

1.2

方法

1.2.1提取pRll01-ON質粒按照質粒提取試劑盒說明書操作。

1.2.2活化菌種 （1）從一80 qC冰箱中取出長期保存的大腸桿菌，用無菌牙簽刮取固體（仔細操作不要讓其融化），然后在LB平板上劃線。

（2）取5mL新鮮LB液體培養基加入支無菌試管中。

（3）用接種環挑1個單菌落，浸沒于培養液中并輕輕搖動接種環，使待接種的細菌分散于培養液中。

（4）蓋好試管，在搖床上以60r/min、37℃條件下振蕩培養至飽和（新鮮培養至飽和期的培養細菌濃度約為10億～20億個/mL），一般須過夜培養。

（5）取出（4）中0.2mL培養物到含有10mL新鮮lJH培養基試管中，在搖床上以220 r/min、37℃振蕩培養，每隔20min取出2支試管，一支放入4℃冰箱統一測定D600nm值，另一支制備感受態細胞。（活化1次）

（6）將活化過1次的大腸桿菌取100uL加入5mL新鮮LH液體培養基在搖床上于60r/rain、37℃條件下振蕩培養至飽和。

（7）取出（6）中O.2 mL培養物到含有10mL新鮮LB培養基試管中，在搖床上于220 r/min、37℃條件下振蕩培養，每隔20MIN取出2支試管，一支放入4℃冰箱統一測定D600NM值，另一支制備感受態細胞。（活化2次）

（8）將活化過2次的大腸桿菌取100uL加入5mL新鮮LH液體培養基在搖床上于60r/rain、37℃條件下振蕩培養至飽和。

（9）取出（8）中0.2mL培養物到含有10mL新鮮LB培養基試管中，在搖床上于220r/min、37℃條件下振蕩培養，每隔20min取出2支試管，一支放入4 qC冰箱統一測定D600nm值，另一支制備感受態細胞。（活化3次）

（10）將活化過3次的大腸桿菌取100uL加入5mL新鮮LB液體培養基在搖床上于60r/min、37℃條件下振蕩培養至飽和。

（11）取出（10）中0.2mL培養物到含有10mL新鮮LB培養基試管中，在搖床上于220r/min、37℃條件下振蕩培養，每隔20min取出2支試管，一支放入4℃冰箱統一測定D600nm值，另一支制備感受態細胞。（活化4次）

1.2.3制備感受態細胞 CaCl2法制備感受態細胞。搖好的菌液試管冰浴30min，分裝成2mL，在4℃、4000g條件下離心8min，棄上清，加800uL冰預冷的0.1mo]/L CaCl：重懸浮，分別使用O.22汕m的濾菌器和高溫滅菌。再在4℃、4000g條件下離心8min，棄上清，加100uL冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸浮，4℃保存12～24h。

1.2.4質粒轉化 把100uL的感受態細胞放置于冰上，加入轉化的10ng DNA，于冰中放置30min。42℃熱激90s，再在冰中放置2～3min，加入37℃條件下預熱好900uL的LB培養基，37℃條件下振蕩1h。取10uL菌液稀釋涂布平板（平板預熱），37℃條件下正向培養1h，再過夜培養。

1.2.5計算轉化子總數=該皿菌落數×稀釋倍數×（轉化反應原液總體積/稀釋倍數）；

轉化頻率=轉化子總數/質粒DNA加入量（ug）。2結果與分析