膠孢炭疽菌漆酶基因Lac2的序列特征與表達分析

韋運謝等

摘要：為了探明分離自芒果的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）漆酶同工酶基因的序列特征，進一步研究該菌的分子致病機理。以該菌為材料，采用同源克隆和RT-PCR法獲得膠孢炭疽菌漆酶基因Lac2（KF924625）。結果表明，其編碼區大小為1 785 bp，編碼594個氨基酸，分子量為65.53 ku，等電點是6.56，含4個銅離子結合保守結構域；聚類分析發現，其預測蛋白與西瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）的漆酶laccase-1（ENH77191.1）同源性最高，達到79%；半定量RT-PCR分析表明，在分生孢子不同萌發時段，Lac2的表達量有明顯的升降趨勢，接種后6 h表達量最低，9 h最高。可見Lac2具備真菌漆酶基因家族的序列特征，初步推測它可能與C. gloeosporioides分生孢子萌發侵染寄主有關，也可能參與調控芒果膠孢炭疽菌的漆酶活性和抗氧化反應等。

關鍵詞：膠孢炭疽菌；Lac2基因；克隆；表達分析

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0035-04

漆酶是含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類化合物及其衍生物，使之生成相應的苯醌和水，且其催化底物具有廣譜性，在環保、食品、醫藥、紡織等各個領域具有潛在的應用價值[1]。最早在漆樹上發現漆酶，隨后發現其也廣泛存在于昆蟲、高等植物、細菌及真菌中[2]。真菌漆酶與致病力、營養生長、增殖生長、孢子和黑色素的形成、氧化脅迫及滲透調節能力相關[3-5]。真菌中存在多種漆酶同工酶，且在不同生長期表達，功能也存在差異[6]，如Colletotrichum orbiculare的Lac1與Lac2的功能截然不同，與野生型相比，Lac2突變體失去了致病力、黑色素含量下降及分生孢子顏色變淺，而Lac1突變體的黑色素含量略微減少、漆酶酶活卻有所上升[7-8]。序列分析表明，不同漆酶基因氨基酸序列相似性不高，但在銅原子結合區域的保守性相當高，因此可以根據這些保守區設計簡并引物同源克隆漆酶基因。

芒果（Mangifera indica L.）隸屬漆樹科芒果屬，是世界五大著名熱帶水果之一。由膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）引起的芒果炭疽病是芒果最嚴重的病害之一，在整個生育期均可發病，且在貯運期危害最重，是限制芒果產業發展的主要因素之一。炭疽病菌的致病過程主要是通過病原菌分生孢子附著在寄主表面，萌發形成附著胞，附著胞內沉積一層黑色素，前端產生侵染釘侵入寄主并在寄主體內擴展，黑色素在病原菌穿透寄主組織中起著非常重要的作用，細胞壁降解酶起著軟化細胞的輔助作用[9-10]，而漆酶又是形成DHN黑色素必不可少的氧化酶[11]，因此推測在芒果炭疽菌中漆酶可能通過干擾附著胞黑色素的合成而影響著該菌的致病力。目前，關于芒果膠胞炭疽菌的漆酶基因僅見筆者所在實驗室報道的Lac1[12]，為了系統研究各漆酶在芒果炭疽菌中的功能，本研究采用同源克隆策略，從芒果膠胞炭疽菌中又克隆獲得了漆酶新基因Lac2，這為進一步研究其功能打下了材料基礎。

1材料與方法

1.1供試菌株

芒果膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）單孢菌株A2由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所鑒定并提供。

1.2方法

1.2.1病原菌菌絲的收集和核酸提取將A2接種至PDA上培養收集菌絲。gDNA 的提取按照OMEGA HP Fungal DNA Kit 說明書操作。RNA 的提取按照OMEGA Fungal RNA Kit說明書操作。

1.2.2Lac2基因的PCR擴增采用同源克隆策略。經本地查找橡膠樹膠孢炭疽菌全基因組測序數據，設計特異引物對Lac2-F（5′-ATGGTCGCCATCAAAGACCTTATGAA-3′）和Lac2-R（5′-TTACTGACCGCTGTCAATGAC-3′）擴增漆酶基因，以C. gloeosporioides基因組gDNA為模板，擴增體系（50μL）：10×PCR Buffer 5μL；dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL；Lac2-F（10 μmol/L）和Lac2-R（10 μmol/L）各2 μL；TaKaRa Taq HS 0.5μL；DNA模板1μL；加ddH2O補至50 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 2min，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物的凝膠回收、連接分別按照OMEGA和TaKaRa相應試劑盒操作。用載體通用引物M13-47和RV-M進行PCR 鑒定后，選擇陽性克隆測序（華大基因生物有限公司）。

1.2.3Lac2基因的RT-PCR擴增用DNAMAN 1.0軟件對所得Lac2基因全序列與GenBank中的嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila）lac基因cDNA序列（索取號：XM-003659795.1）比對分析后，用推定的cDNA序列設計引物對RLac2 -F（5′-TCGCCATCAAAGACCTTATGAAA-3′）和RLac2 -R（5′-ACCTGGTCAACCTTGGACGGGAT-3′）用于擴增Lac2的cDNA。RT-PCR按照PrimeScriptTM Ⅱ High Fidelity RT-PCR Kit說明書操作，其余同上。

1.2.4Lac2序列分析用Expasy 的ProtParam 在線分析軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）分析該蛋白序列組分；利用Clustal X 1.81 軟件進行多重序列比對，采用MEGA 5.1 軟件通過neighbor-joining 方法構建系統進化樹，其中bootstrap設為1000 replicates。其余參照文獻[12]。

1.2.5Lac2基因在分生孢子不同萌發時段的半定量表達分析通過篩選，選用真菌18S rRNA通用引物作為內參基因（SR5：5′-GTGCCCTTCCGTCAATT-3′，SR7R：5′-AGTTAAAAAGCTCGTAGTTG-3′）；根據已獲得的Lac2 cDNA序列，設計半定量引物對qLac2 -F（5′-ACAACGGTAGCGTTCGTGTTATTG-3′）和qLac2 -R（5′-ACCTGGTCAACCTTGGACGGGAT-3′）。參照文獻[13]，配制1×107/mL的孢子懸浮液，取6 mL均勻涂布于保鮮膜上，保濕密閉，置于28 ℃ 黑暗培養，分別收集處理0、1、2、4、6、9、12、18 h 后的分生孢子，提取總RNA。擴增體系（25 μL）：Primer STAR HS 12.5 μL；qLac2 -F（10 μmol/L）和qLac2 -R（10 μmol/L）各1 μL；cDNA模板1μL；加ddH2O補至25 μL。擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，34個循環；72 ℃ 7 min。

2結果與分析

2.1芒果膠胞炭疽菌Lac2基因的克隆

用設計的特異引物對Lac2 -F和Lac2 -R，以芒果膠胞炭疽菌gDNA為模板擴增獲得了約2 000 bp的片段（圖1），與預期的序列大小一致。雙向測通結果表明，插入的目的片段大小為1 966 bp。經BLASTN分析發現，該片段與多個不同物種的漆酶基因序列有很高的相似性，最高達81%，但與已報道的芒果膠胞炭疽菌Lac1[12]的同源性僅為24.58%，說明該片段為芒果膠胞炭疽菌的另一個漆酶基因，命名為Lac2基因。用Primer 5.0軟件推測Lac2基因編碼的氨基酸序列，發現目的片段含完整的開放閱讀框。

2.2RT-PCR擴增獲得Lac2的cDNA序列

經RT-PCR擴增獲得約1 800 bp的cDNA片段（圖1），測序表明大小為1 785 bp。該序列已提交GenBank，登錄號為KF924625。

2.3Lac2序列分析

2.3.1Lac2基因全長DNA與cDNA序列分析比對分析Lac2基因DNA和cDNA序列，發現含1個1 785 bp大小的開放閱讀框，起始密碼子ATG位于第1～3 bp處，終止密碼子TAA位于第1 964～1 966 bp處，自ATG到TAG的DNA全長1 966 bp，其中存在3個大小分別57、71、53bp的內含子（位于第86～143、565～636和1 564～1 617堿基處），是典型的真菌內含子的長度（49 ～85 bp），所有內含子均符合GT-AG法則。用BioEdit軟件分析結果表明：Lac2基因編碼序列的雙鏈核苷酸分子量大小為1 087.22 ku，（G+C）摩爾百分含量為 56.86%，（A+T）摩爾百分含量為43.14%，可見該編碼區富含GC堿基，其中C的摩爾百分含量最高，為34.01%。

2.3.2Lac2基因預測蛋白的生化特征分析用Primer 5.0軟件預測Lac2基因編碼594個氨基酸，其中參照文獻[14]發現其中含有5個可能的N-糖基化位點（Asn-X-Thr/Ser）（分別位于第9～11、152～154、394～396、401～403、580～582氨基酸處），分子量約為65.53 ku，包括59個強堿性氨基酸（KRH）、47個強酸性氨基酸（DE）、242個非極性氨基酸（AVLIPFWM）、352個極性氨基酸（GSTCYNQKRHDE），等電點（pI）為6.56，可見是一種偏酸性蛋白質，富含極性氨基酸，特別是天冬酰胺（Asn）、甘氨酸（Gly）的含量分別達9.1%和8.2%。在真菌漆酶中，由于Cu原子結合保守區的Cys殘基下游的第10個氨基酸殘基種類對漆酶氧化還原潛能具有重要作用，Shin據此將漆酶分為3類：1型（Met）、2型（Leu）和3型（Phe）[15]，按此分類標準，Lac2屬于2型漆酶。漆酶屬含銅的多酚氧化酶，對Lac2的氨基酸序列分析發現它具有4個銅離子結合區域（His-X-His）、10個銅離子結合位點（圖2）。

2.3.3Lac2基因預測蛋白的同源性分析將該基因編碼的氨基酸序列提交NCBI進行BLASTP同源比對，分析表明該漆酶與已發表的C. orbiculare MAFF 240422 laccase-1 precursor（ENH77191.1）、C. higginsianum multicopper oxidase（CCF34868.1）、C. graminicola M1.001 multicopper oxidase（EFQ36357.1）、Trichoderma sp. T01 laccase（ACS45199.1）、Gaeumannomyces graminis var. tritici R3-111a-1 laccase-1（EJT70878.1）、Fusarium oxysporum f.sp. cubense race 1 Laccase-2（ENH66075.1）、Metarhizium acridum CQMa 102 Lcc1（EFY87101.1）、F. proliferatum laccase（AAK72901.1）和F.oxysporum f.sp. lycopersici Lcc1（ABS19938.1）基因編碼的蛋白同源性較高，相似性分別為79%、78%、70%、63%、61%、61%、61%、61%和60%。系統聚類結果表明（圖3）：Lac2預測蛋白可能與西瓜炭疽菌（C. orbiculare）的laccase類或禾生炭疽菌（C. graminicola）的multicopper oxidase聚為一類。

2.3.4Lac2基因預測蛋白的保守結構域分析利用NCBI 的Blast 軟件（http：//www.nebi.nlm.nih.gov/strueture/cdd/wrpsb.cgi）進行Lac2基因預測蛋白的結構域分析（圖4），發現該蛋白中含有Cu-oxidase 保守結構域，說明Lac2蛋白屬于含銅的氧化物酶類。

2.4Lac2基因在分生孢子不同萌發時段的半定量表達分析

在膠孢炭疽菌分生孢子萌發過程中，Lac2 在不同時期表達量不盡相同（圖5），有明顯的升降趨勢，總體呈“升—降—升—降”趨勢，0 h Lac2 的表達比較弱，0～4 h表達量逐漸上升，至4 h 達到第1個波峰，而6 h時突然減弱，9 h 又突然達到第2個波峰，隨后逐漸減弱；總體上在處理6 h 后表達量最低，9 h 后達到最高。據此初步推測Lac2與C. gloeosporioides分生孢子萌發后侵染寄主有關。

3討論

漆酶一般含有4個銅離子結合區，不同漆酶基因所編碼的氨基酸序列的同源性較抵，但銅原子結合區保守性高，該區是鑒定獲得基因是否為漆酶基因的主要依據[7]。筆者所在實驗室先后發現的膠孢炭疽菌的2個漆酶基因Lac1和Lac2的氨基酸序列同源性僅24.58%，而對應的銅原子結合區保守性較高。可見，根據銅原子結合區保守序列設計簡并引物是克隆漆酶基因有效途徑。

漆酶基因廣泛存在于子囊菌和擔子菌中，在不同的生長條件、生長周期及侵染過程的表達量不同。在不同培養條件下，小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）的3種同工漆酶的表達量存在明顯差別，其中Lac1均表達，Lac2只在含有CuSO4的培養基上表達，而Lac3的表達僅在含寄主濾液的基礎培養基上才能檢測到[16]；番茄枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. lycopersici）的Lac2、Lac4和Lac5在整個侵染過程中均不表達，而Lac1、Lac3和Lac9能表達，但時間上存在差異[3]。C. gloeosporioides孢子懸浮液處理9 h后，80%以上的炭疽菌分生孢子萌發并形成附著胞，開始侵染寄主[17]；本試驗Lac2在侵染0～18 h時段中，9 h表達量最高，因此推測Lac2可能與C. gloeosporioides分生孢子萌發侵染寄主相關。

在不同植物病原真菌中的漆酶的功能差異較大。番茄枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. lycopersici）的3個漆酶基因（lac1、lac3和lac5）的缺失突變體對致病力均無影響，而Δlac3與氧化脅迫能力及對酚類化合物的敏感性相關，Δlac1與氧化脅迫能力及漆酶酶活相關[3]；玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）的漆酶基因（StLAC1）缺失突變體不能形成分生孢子，附著胞膨壓、致病力、黑色素合成明顯減弱，菌落顏色由灰黑色變為灰白色[4]；與本研究克隆的Lac2基因編碼的蛋白同源性達70%以上的C. orbiculare laccase-1 precursor（ENH77191.1）、C.higginsianum multicopper oxidase（CCF34868.1）和C.graminicola multicopper oxidase（EFQ36357.1）未見相應基因功能鑒定的報道，而Lac2編碼蛋白與F. oxysporum f. sp. lycopersici的Lac1編碼的漆酶有較高的序列相似性，且Lac1與抗氧化反應及漆酶酶活有關，因此推測芒果膠胞炭疽菌的Lac2基因可能也有相似的功能。但由于芒果膠胞炭疽菌與上述真菌在生活史、侵入寄主的方式、致病因子等方面均存在差異，該基因的具體功能還有待進一步研究。

參考文獻：

[1]靳蓉，張飛龍. 漆酶的應用技術[J]. 中國生漆，2013，32（2）：35-42.

[2]Widsten P，Kandelbauer A. Laccase applications in the forest products industry：a review[J]. Enzyme and Microbial Technology，2008，42（4）：293-307.

[3]Cordoba C D，Roncero M I. Functional analyses of laccase genes from Fusarium oxysporum[J]. Phytopathology，2008，98（5）：509-518.

[4]詹旭. 玉米大斑病菌漆酶基因StLAC1在黑色素合成中的功能分析[D]. 保定：河北農業大學，2011.

[5]Fan X，Zhou Y，Xiao Y，et al. Cloning，expression and phylogenetic analysis of a divergent laccase multigene family in Auricularia auricula-judae[J]. Microbiological Research，2014，169（5/6）：453-462.

[6]肖書笑，田呈明，王永林. 黃櫨枯萎病菌漆酶基因的鑒定及其在微菌核形成過程中的表達研究[J/OL]. [2013-12-20]. http：//www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201312-625.

[7]Tsuji G，Fujikawa J，Ishida H. Laccase gene LAC1 of Colletotrichum lagenarium is not essential for melanin biosynthesis and pathogenicity[J]. Journal of General Plant Pathology，2001，67（3）：182-190.

[8]Lin S Y，Okuda S，Ikeda K，et al. Lac2 encoding a secreted laccase is involved in appressorial melanization and conidial pigmentation in Colletotrichum orbiculare[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2012，25（12）：1552-1561.

[9]王葵娣，王文華，鄭服叢. 炭疽菌附著胞的研究進展[J]. 中國農學通報，2007，23（1）：265-270.

[10]王洪凱，林福呈，王政逸. 植物病原真菌附著胞的機械穿透力[J]. 菌物學報，2004，23（01）：151-157.

[11]Butler M J，Gardiner R B，Day A W. Melanin synthesis by Sclerotinia sclerotiorum[J]. Mycologia，2009，101（3）：296-304.

[12]韋運謝，劉曉妹，張賀，等. 芒果炭疽病菌漆酶基因lac1的克隆與序列特征分析[J]. 果樹學報，2013，30（2）：202-206.

[13]Takano Y，Kubo Y，Kuroda I，et al. Temporal transcriptional pattern of three melanin biosynthesis genes，PKS1，SCD1，and THR1，in appressorium-differentiating and nondifferentiating conidia of Colletotrichum lagenarium[J]. Applied and Environmental Microbiology，1997，63（1）：351-354.

[14]李劍鳳，洪宇植，肖亞中. 栓菌420漆酶同工酶B基因克隆及異源表達[J]. 生物學雜志，2007，24（3）：25-28.

[15]Shin K S，Lee Y J. Purification and characterization of a new member of the laccase family from the white-rot basidiomycete Coriolus hirsutus[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2000，384（1）：109-115.

[16]Litvintseva A P，Henson J M. Cloning，characterization，and transcription of three laccase genes from Gaeumannomyces graminis var. tritici，the take-all fungus[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（3）：1305-1311.

[17]王科. 黃柏炭疽病（Colletotriehum gloeosporioides）的研究[D]. 雅安：四川農業大學，2010.