峨眉大黃姜的莖尖脫毒與植株再生

張玨等

摘要：為提高姜莖尖成苗率及試管苗的增殖效率，以峨眉大黃姜為供試材料，以MS為基礎培養(yǎng)基，研究了不同激素配比對峨眉大黃姜莖尖成芽率、試管苗增殖率、生根效果的影響。試驗結果表明，激素配比為MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.3 mg/L 時，誘導莖尖成芽效果最好，成芽率為83.3%。脫毒苗叢生芽誘導最佳激素配比為：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導率為92.5%，平均芽數(shù)為12.4個；生根效果激素配比以MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L為最佳，誘導率為100%，平均生根數(shù)為17.6條。

關鍵詞：峨眉大黃姜；莖尖脫毒；激素配比；植株再生

中圖分類號： S632.504文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0077-03

收稿日期：2014-11-19

基金項目：四川省教育廳科研項目（編號：13ZB0342）；成都學院人才工程科研啟動項目（編號：20819031）。

作者簡介：張玨（1976—），女，四川成都人，博士，講師，主要從事藥用植物資源開發(fā)及利用研究。Tel：（028）84616308；E-mail： zhangjue@cdu.edu.cn。

通信作者：王躍華，教授，主要從事藥用植物資源開發(fā)及利用研究。E-mail：wangyaohua888@yahoo.com.cn。姜（Zingiber officinale Rosc）[1]為姜科姜屬多年生宿根草本植物。姜科植物姜的根莖，形如掌狀，它含有揮發(fā)油、姜辣素、黃酮類、酚類等物質及多種氨基酸[2]，是一種用途廣泛的藥食兼用植物。近年來，隨著食療保健在全世界范圍的興起，各國食品、醫(yī)藥、生物學家對姜的研究日益廣泛，姜在食品工業(yè)中的開發(fā)前景廣闊。人們已經對姜的成分、藥理、栽培技術和快速繁殖等方面有了較多的研究。姜以根狀莖作為繁殖材料，繁殖系數(shù)低，容易通過種姜傳播病害而且長期無性繁殖造成種性退化。1977年Hosoki等首先進行姜組織培養(yǎng)的研究[3]，迄今為止，在脫毒快繁、花器官培養(yǎng)、體細胞胚胎發(fā)生、器官發(fā)生、原生質體培養(yǎng)和種質保存等方面取得了一定進展[4]。目前對姜的莖尖脫毒及植株再生研究較多，但對于較有四川特色的峨眉大黃姜的莖尖脫毒及離體快繁還未見報道。本試驗通過對峨眉大黃姜的莖尖剝離和離體培養(yǎng)來快速繁殖姜脫毒種苗，研究不同濃度激素配比對莖尖的成苗率、叢生芽誘導率、生根的影響，以期篩選出大黃姜繁殖速度快、縮短培養(yǎng)周期、建立快繁技術體系的最佳激素配比，為解決峨眉大黃姜品種退化問題和實現(xiàn)脫毒種苗的規(guī)模化、工廠化生產奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

峨眉大黃姜的根狀莖由四川農業(yè)大學農學院藥用植物園惠贈。

1.2方法

1.2.1外植體的獲取及消毒精選塊大、皮色黃亮、無病蟲危害的健壯根狀莖作為外植體，洗凈表面泥土后，用50%多菌靈可濕性粉劑800倍液對其進行消毒15 min，置于（37±2）℃條件下恒溫培養(yǎng)箱熱處理28 d鈍化病毒，待姜芽長至10～2.5 cm時，將姜芽掰下，用自來水沖洗1～2 h，移入接種室。在超凈工作臺上剝去姜芽表層葉片，用75%乙醇消毒 20 s，用無菌水沖洗3次，再用0.1%氯化汞消毒10 min后，用無菌水洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分，體視顯微鏡下用解剖針剝離莖尖（約0.3～0.5 mm）并將其接種于誘導培養(yǎng)基上。

1.2.2莖尖離體培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加不同濃度激素，研究不同濃度配比對莖尖分化成苗的影響。主要采用不同濃度GA3和6-BA進行試驗設計，GA3濃度為0.1、0.3 mg/L，6-BA濃度為0.1、0.2 mg/L，并結合 005 mg/L NAA作為莖尖培養(yǎng)的培養(yǎng)基，每處理10個莖尖，重復3次。各處理培養(yǎng)基配方分別為： （1）：MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3；（2）：MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L GA3；（3）：MS+ 0.05 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3；（4）：MS+0.05 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L GA3。將姜莖尖接種至上述培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)，每3 d觀察1次，待莖尖伸長膨大后，置于光照度為1 800～2 000 lx、光照時數(shù)14 h/d、溫度26 ℃條件下進行培養(yǎng)，每3 d觀察1次，60 d 后統(tǒng)計成活率，80 d后統(tǒng)計成苗率，比較各處理的成活率、成芽率的差異。待莖尖成苗后，繁殖到一定量剪其葉片進行病毒檢測（酶聯(lián)免疫吸附法），經檢測合格后進行繼代培養(yǎng)。

1.2.3脫毒苗叢生芽誘導增殖培養(yǎng)將病毒檢測合格的脫毒苗轉接于含不同濃度激素配比的MS快繁誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，篩選最佳增殖培養(yǎng)基配方。各處理的培養(yǎng)基配方分別為：（5）：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L； （6）：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；（7）：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；（8）：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；（9）：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；（10）：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。每處理接種5瓶，每瓶6苗，重復3次。每5 d觀察1次，比較不同激素配比對姜脫毒苗叢生芽誘導增殖效率的影響，并篩選最佳誘導培養(yǎng)基。

1.2.4根的誘導將苗高3 cm左右的叢生芽分成單株，轉入不同濃度激素配比的1/2MS生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基配方分別為：（11）： 1/2MS+0.5 mg/L NAA；（12）： 1/2MS+1.0 mg/L NAA；（13）： 1/2MS+0.1 mg/L IBA；（14）： 1/2MS+0.5 mg/L IBA；（15）： 1/2MS+0.1 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA。培養(yǎng)基中加入3.0%蔗糖、0.45%瓊脂、0.2%活性炭，pH值5.6～5.8。每處理接種10瓶，每瓶3苗，重復3次。每7 d觀察1次，比較不同激素配比對姜組培苗生根的影響，并篩選最適生根培養(yǎng)基。最后將生根誘導成功的組培苗移栽到基質中，在大棚中進行煉苗，培養(yǎng)10 d后，統(tǒng)計成活率。

2結果與分析

2.1不同激素配比培養(yǎng)基對峨眉大黃姜莖尖分化成芽的影響

將體視顯微鏡下剝離的莖尖培養(yǎng)在不同激素配比的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 d左右開始出現(xiàn)愈傷組織，27 d左右莖尖基部膨大（圖1）。30 d后觀察其成活率，60 d后觀察成芽率，試驗結果見表1。峨眉大黃姜莖尖在3號培養(yǎng)基中的成活率最高，達100%，但成芽率僅為60.0%，并且在莖尖與培養(yǎng)基的接觸面形成大量愈傷，生長速度較快； 2號培養(yǎng)基成活率其次，成活率為93.3%，成芽率最高，達83.3%，無愈傷形成，莖尖膨大伸長、生長速度較快；1號培養(yǎng)基的成芽率最低，為46.7%，莖尖基部膨大有少量愈傷形成，生長速度較慢；4號培養(yǎng)基中莖尖的成活率低于其他處理組，成芽率比2號培養(yǎng)基低，但莖尖與培養(yǎng)基的接觸面與3號一樣也形成大量愈傷且生長速度較快。因此采用2號培養(yǎng)基對峨眉大黃姜莖尖進行培養(yǎng)效果較好。

表1不同激素配比對莖尖成活率及成芽率的影響

培養(yǎng)基號成活率（%）成芽率（%）186.7 46.7 293.3 83.3 3100.0 60.0 480.076.7

2.2不同激素配比對峨眉大黃姜叢生芽誘導的影響

選取生長狀況良好且相對一致的脫毒苗分別接入不同激素配比叢生芽誘導培養(yǎng)基中，試驗結果見表2。7號培養(yǎng)基誘導的叢生芽分化快、生長旺盛、芽數(shù)最多且健壯，叢生芽誘導率為92.5%，誘導效果最佳；6號培養(yǎng)基誘導的叢生芽芽數(shù)為8.4個/株，生長較快，芽色淺綠，但芽較纖細，叢生芽誘導率為85.7%，誘導效果次之；10號培養(yǎng)基誘導產生的叢生芽分化慢、芽量少且植株細弱，叢生芽誘導率為56.2%，誘導效果最差。因此，選擇7號培養(yǎng)基為峨眉大黃姜叢生芽誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 d后，產生的叢生芽見圖2。表2不同激素配比對峨眉大黃姜莖尖脫毒苗分化出叢生芽的影響

培養(yǎng)基號叢生芽誘導率

（%）平均芽數(shù)

（個/株）試管苗生長情況575.43.5芽數(shù)較少、淺綠色、纖細、生長較快685.78.4芽數(shù)較多、淺綠色、較纖細、生長快792.512.4芽數(shù)多、綠色、較健壯、生長快866.55.6芽數(shù)較少、黃綠色、較健壯、生長較快972.44.6芽數(shù)少、黃綠色、較纖細、生長較慢1056.23.1芽數(shù)少、黃綠色、較纖細、生長慢

2.3試管苗根的誘導

選取生長狀況基本一致且生長良好的叢生芽，分成單芽后接入誘導生根的培養(yǎng)基中。每個培養(yǎng)瓶接種3個單芽，每組接種10個培養(yǎng)瓶，試驗結果見表3。5種培養(yǎng)基的生根誘導率均為100%。其中15號培養(yǎng)基平均根數(shù)17.6條，根量最

表3不同激素配比對峨眉大黃姜叢生芽誘導生根的影響

培養(yǎng)基號生根誘導率

（%） 平均根數(shù)

（條）根生長情況1110012.9根量一般、較粗壯1210011.7根量少、纖弱1310012.0根量一般、較纖弱1410016.3根量較多、較粗壯1510017.6根量多、粗壯發(fā)達

多，且粗壯發(fā)達，根生長情況良好；其次為14號培養(yǎng)基，平均根數(shù)為16.3條，根量較多，根較粗壯，根的生長情況較15號培養(yǎng)基略差；12號培養(yǎng)基平均根數(shù)為11.7條，根量少且根纖弱。試驗結果表明，15號培養(yǎng)基為最佳誘導生根的激素配比。使用15號培養(yǎng)基誘導叢生芽生根，培養(yǎng)25 d后的誘導生根約1.5 cm（圖3）。

將生根成功后的組培苗接種到基質培養(yǎng)基中，在大棚中進行煉苗，培養(yǎng)10 d后，成活率可達90%以上，移栽成活的組培苗見圖4。

3結論與討論

在姜莖尖的離體培養(yǎng)中不同激素配比對其成活率、成芽率及生長狀態(tài)的影響是一個極為重要的環(huán)節(jié)[5-8]。試驗結果表明，MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.3 mg/L為誘導莖尖的最佳激素配比，莖尖誘導的成活率為93.3%，成芽率為83.3%。本結論與周慶紅等在姜莖尖脫毒培養(yǎng)研究得出的研究結果[9]不一致，成活率和成芽率與其研究結果相比均有所提高。王桂梅等認為在加入外源激素6-BA和NAA時，都能誘導莖尖萌動和愈傷組織產生，但添加GA3后可提高莖尖的生長速度和成芽率[10]。

本研究峨眉大黃姜叢生芽誘導最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L時，叢生芽的數(shù)目較多，平均數(shù)達12.4個，出芽率為92.5%，且生長健壯，本結論與黃遠新等的生姜莖尖離體培養(yǎng)研究結果[11]不一致，原因可能是姜的不同品種間及發(fā)育狀態(tài)可能存在一定差異，導致其葉片內的內源激素水平以及對外源激素的敏感性不同[12]，從而對相似激素配比的反應有較大差異，這不僅表現(xiàn)在對叢生芽的誘導上，對莖尖、生根等的誘導同樣會產生影響。

生根培養(yǎng)結果，生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L時誘導效果最好，生根率為100%，平均生根數(shù)達17.6條，即IBA與NAA配合使用的誘導生根效果更好。當只用1種激素時，NAA誘導生根效果優(yōu)于IBA。這與潘學峰等的研究結論[13]有所差異，本試驗11號培養(yǎng)基（MS+NAA 0.5 mg/L）為最佳生根培養(yǎng)基，本結論與杭玲等對生姜莖尖離體培養(yǎng)研究得出的結論[14]相似，他們認為IBA或NAA均可進行生根誘導，但配合使用效果更佳。

峨眉大黃姜莖尖離體培養(yǎng)及植株再生的影響因子中，不同組合的激素配比起著非常重要的作用。試驗中選擇了利用莖尖成芽后直接誘導叢生芽成苗，然后再進行根的誘導，簡化了培養(yǎng)步驟，縮短了整個培養(yǎng)周期，能很好保持植株的優(yōu)良性狀，有效提高了莖尖脫毒快繁的速度，降低了生產成本，更有利于脫毒苗的工廠化生產。

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