烤煙不同生育期蔗糖代謝關鍵酶基因的表達

馬俊紅　李軍營　馬二登　盧秀萍

摘要：為了研究烤煙不同生育期蔗糖代謝的分子特點，采用SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR法對云煙87在不同生育期的3種蔗糖代謝關鍵酶基因——轉化酶（invertase，Inv）、蔗糖合成酶（sucrose synthase，SuSy）和蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）基因的表達水平進行分析。結果表明：在煙葉發育前期（團棵期、旺長期）Inv酶基因的表達量較高；SuSy酶基因的在烤煙不同生育期的表達量變化呈單峰曲線，在打頂后表達量最高，之后又降低。SPS酶基因的表達量在烤煙生長發育后期較高，說明烤煙蔗糖的累積主要在發育后期進行。

關鍵詞：烤煙；生育期；蔗糖代謝；轉化酶；蔗糖合成酶；蔗糖磷酸合成酶；基因表達

中圖分類號：S572.01 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0032-03

烤煙是世界上一種重要的經濟作物，煙葉的品質與其糖含量密切相關，水溶性糖與氨基酸發生梅拉德反應可以產生多種香氣物質。蔗糖是主要的水溶性糖之一，也是煙草光合作用的主要產物，可以為煙草的生長提供碳源和能量，同時也是細胞代謝的調控因子，可調節轉運蛋白、貯藏蛋白和編碼酶的基因的表達。與蔗糖代謝密切相關的酶主要有轉化酶（invertase，Inv）、蔗糖合成酶（sucrose syn-thase，SuSy）和蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）。SPS是調控植物蔗糖合成的關鍵酶之一，其活力直接影響光合產物的分配，研究表明其與蔗糖形成呈正相關。SuSy是一種可逆酶，既可催化蔗糖的合成，又可催化蔗糖的分解，通常認為，它主要起分解蔗糖的作用，能為細胞壁提供合成底物和合成淀粉。Inv酶與植物體內形成蔗糖梯度相關，Bachelier等研究表明，處在細胞壁中的轉化酶能調節蔗糖從韌皮部卸出，并且控制蔗糖吸收速度，而在液泡中的轉化酶則可以調節蔗糖和己糖的貯存。

本研究通過對烤煙品種云87在團棵期、旺長期、現蕾期、打頂后、成熟期5個生育期的蔗糖含量，Inv酶、SuSy酶、SPS酶活性以及3個酶基因的表達情況進行測定，從而明確不同生育期蔗糖代謝主要酶活性及酶基因的變化特點，揭示烤煙不同生育期蔗糖代謝的分子特點，并為改善烤煙品質提供理論依據。

1.材料與方法

1.1供試材料

試驗地點設在云南省玉溪研和基地，在移栽后第20天（團棵期）、第40天（旺長期）、第60天（現蕾期）、第80天（打頂后）、第1130天（成熟期）采集云煙87的第12張葉（自下而上），將新鮮煙葉1g放入液氮罐冷凍后，置于-80℃保存備用。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA的提取

總RNA提取按照RNAiso Plus和RNAiso-mate fnr Plant Tissue試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]說明書進行。用核酸蛋白紫外分析儀檢測D260nm/D280nm的比值以鑒定RNA抽提質量，1.8≤D260nm/D280nm≤2.0，表明總RNA質量較好，同時測定其標本總RNA濃度。

1.2.2總RNA的反轉錄反轉錄反應用PrimeSeriptⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]進行，具體方法參照試劑盒說明書。

1.2.3引物設計選擇內參基因Actin以及3個關鍵酶基因（蔗糖合成酶基因、蔗糖磷酸合成酶基因以及蔗糖轉化酶基因），按照實時熒光定量PCR擴增的引物設計原則，避免引物3'端互補，以及“發卡”結構，引物的長度為18～22bp，注意堿基的隨機分配，GC含量在40%～60%之間，擴增片段小于200bp。并應用Primer3（v.0.4.0）軟件設計相應的擴增引物。引物合成由Inviirogen公司完成。引物序列見表1。

1.2.4實時熒光定量RT-PCR分析以受試材料葉片反轉錄cDNA為模板，Real—time qPCR擴增反應試劑SYBRPremix Ex TaqI（Perfect Real Time）來自寶生物工程（大連）有限公司。Real-time qPCR擴增和分析在Mx3005PQPCR System熒光定量PCR儀（stratagene）上進行，采用96孔反應模塊。反應體系：2×SYBR Premix 12.5uL，ForwardPrimer0.4umol/L，Reverse Primer 0.4 txmol/L，Rox1 txmol/L，補充至25uL。擴增反應條件：95 qC 30 s，1個循環；95℃ 5s，58℃ 30s，45個循環；95℃ 30s，58℃ 1min，95℃ 1min，1個循環。PCR反應結束后，65～95℃產生溶解曲線，閾值線由Mx Pro軟件自動設定。每個樣品重復3次，不同時期樣品的表達量檢測均在相同的real—time PCR循環中進行，以保證標準樣品和處理樣品擴增條件一致。

1.2.5數據分析試驗結果最少是3次試驗的平均值。用2的方法計算待測基因的相對表達水平。其中，各基因在對照情況下的相對表達量設定為1.0。采用Excel 2003進行數據處理與作圖，采用SISS 13.0進行統計學分析。

2.結果與分析

2.1烤煙不同生育期蔗糖轉化酶基因的表達分析

蔗糖轉化酶（Inv）的活性標志著植物葉片對光合產物利用的強度，也是碳代謝的重要標志之一。從圖1中可以看出，烤煙蔗糖轉化酶基因的表達隨著烤煙的生長發育從團棵期到成熟期逐漸減弱，在團棵期Inv酶基因的表達最強，從旺長到現蕾期Inv酶基因的表達量急劇降低，從現蕾期至成熟期表達量維持在較低水平，且相對比較穩定。說明在煙葉發育早期主要由Inv酶催化蔗糖的水解，且在發育的早期煙株對光合產物利用的強度最大。而后期Inv酶基因的表達量降低有助于煙葉蔗糖的累積。

2.2烤煙不同生育期蔗糖合成酶基因的表達分析

蔗糖合成酶是促使蔗糖進入各種代謝途徑的關鍵酶之一。從圖2可以看出，云煙87蔗糖合成酶基因的表達量呈先升高后降低的趨勢，從團棵期、旺長期到現蕾期逐漸升高，在打頂獲普蔗糖合成酶基因的表達量急劇升高，同時達到最大值，到成熟期表達量則急劇下降，說明在煙葉生長后期，蔗糖降解主要通過蔗糖合成酶途徑來完成的，而成熟期煙葉需要累積蔗糖，因而SuSy酶基因的表達量下降，有助于煙葉適時成熟。

2.3烤煙不同生育期蔗糖磷酸合成酶基因的表達分析

蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物體內控制蔗糖合成的關鍵酶。植物體內蔗糖的積累與SIS活性正相關，SIS還參與植物的生長和產量形成，并在植物的抗逆過程中起重要作用。從圖3可以看出，云煙87在團棵期、旺長期、現蕾期3個時期的蔗糖磷酸合成酶基因表達量均較低，而打頂后和成熟期的SIS基因表達量較高，且遠高于煙株生長發育前3個時期的表達量，說明烤煙蔗糖的累積主要在烤煙生長發育后期進行。

3.結論與討論

蔗糖是高等植物光合作用的主要產物，參與蔗糖代謝和積累的酶主要包括蔗糖轉化酶、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶。本研究首次應用實時熒光定量RT-PCR的方法，對云南烤煙不同生育期蔗糖代謝和積累過程中的3種主要酶基因的表達情況進行了分析。蔗糖是觸發衰老的因子，糖分的積累會抑制光合基因的表達，從而引起煙葉的早衰。Huber曾指出SPS酶活力越高，蔗糖積累的越多。同樣，本試驗的研究結果也表明，SPS基因表達量在烤煙生長發育前期較低，蔗糖積累相應較少，不會導致煙葉早熟，而在后期表達量較高，蔗糖積累量較多，有利于煙葉適時成熟。

蔗糖轉化酶基因的表達隨植物生長發育時期的不同而改變，存在時間和空間的差異。Inv被認為參與了植物的生長和器官建成。許多研究表明，一般在植物的分生組織和快速生長的幼嫩的組織和器官中（如幼嫩的葉片、莖、花芽、根尖、幼嫩的果實等）Inv活性較高。同樣，本研究也證實了這一結論，Inv酶基因的表達在團棵期和旺長期最強，即在烤煙生長發育的前期，此時煙葉幼嫩，而到后期則該基因的表達量下降。

在煙葉發育早期主要由Inv酶催化蔗糖的水解，到生長后期，蔗糖降解主要通過蔗糖合成酶催化的途徑來完成。本研究顯示，云煙87在打頂后SuSy酶基因的表達量最高，而這一生育期的Inv酶基因的表達量則較低，說明打頂后蔗糖降解的主要途徑通過蔗糖合成酶催化來完成的。而在成熟期Inv和SuSy酶基因的表達量均較低，可能是因為在成熟期煙葉需要累積蔗糖，從而達到適時成熟。

但是，由于蔗糖代謝過程中還涉及到眾多的其他酶，同時，人們對基因表達與酶活性的之間對應關系了解的也并不透徹，因此，蔗糖的積累與Inv酶、SPS酶、SuSy酶基因表達以及酶活性的精確關系還有待于進一步的研究。