原生質(zhì)體單核化技術(shù)在白靈菇菌種提純復(fù)壯中的應(yīng)用

李莎+劉宇+馬康+馬元偉+李明+許峰

摘要：為了探索原生質(zhì)體單核化技術(shù)在白靈菇菌株提純復(fù)壯中的應(yīng)用，用退化的白靈菇菌株自10進(jìn)行原生質(zhì)體單核化，得到121個(gè)原生質(zhì)體單核菌絲，通過平扳對峙試驗(yàn)，選取2個(gè)菌落中間有突起的部位轉(zhuǎn)接至新PDA平板，鏡檢保留有鎖狀聯(lián)合的菌株，最后得到1株菌絲潔白、濃密的菌株，命名為自交45×49。通過測定菌絲生長速度、生物量、木質(zhì)纖維素降解酶的活性對復(fù)壯菌株進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果顯示，自交45×49菌株與白10菌株在液體PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d后的菌絲生物量分別為1.58、0.90mg/mL；一級種與二級種菌絲生長速度差異未達(dá)0.01顯著水平；自交45×49菌株的漆酶活性比白10強(qiáng)43.47%。由此證明原生質(zhì)體單核技術(shù)在白靈菇菌株的提純復(fù)壯中應(yīng)用的可行性。

關(guān)鍵詞：菌種退化；白靈菇；原生質(zhì)體單核化；提純復(fù)壯

中圖分類號：S646.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0248-02

白靈菇（Pleurotusnebrodensis）屬于擔(dān)子菌門傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬，肉質(zhì)鮮美，有“素鮑魚”的美稱，但是菌種退化問題一直困擾著白靈菇的育種進(jìn)程。而菌種退化導(dǎo)致的產(chǎn)量、生物學(xué)效率、商品價(jià)值降低，畸形菇數(shù)量增加，經(jīng)濟(jì)效益減少也制約白靈菇的工廠化發(fā)展。那么，如何對菌種進(jìn)行提純復(fù)壯成了關(guān)鍵問題。漆酶是含有4個(gè)銅的胞外氧化酶，屬于銅藍(lán)氧化酶，存在于菇、菌及植物中，可以選擇性地降解木質(zhì)素，而退化的菌株漆酶含量會(huì)下降；纖維素酶是一個(gè)由多種水解酶組成的復(fù)雜的酶系，產(chǎn)生纖維素酶的菌種易退化，退化后其產(chǎn)酶力明顯降低。本試驗(yàn)采用原生質(zhì)體單核化技術(shù)，以白10作為試驗(yàn)材料，進(jìn)行單核菌絲平板對峙試驗(yàn)，獲得1株優(yōu)良復(fù)壯的菌株，命名為自交45×49。通過測定自交45×49和白10在PDA平板和大試管栽培料中的菌絲生長速度、生物量、漆酶和纖維素酶活力，以驗(yàn)證提純復(fù)壯菌株的生長活力。

1.材料與方法

1.1菌種材料

本試驗(yàn)的白10菌株來自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所食用菌研究室。

1.2供試培養(yǎng)基

PDA綜合培養(yǎng)基、PDB液體培養(yǎng)基、RM再生培養(yǎng)基、大試管培養(yǎng)基的成分均見文獻(xiàn)[3]。

1.3主要試劑的配制

0.6mol/L甘露醇穩(wěn)滲液、2%溶壁酶溶液、滲透壓穩(wěn)定劑的配制參見文獻(xiàn)[4]；ABTS溶液的配制參見文獻(xiàn)[5]；3，5-二硝基水楊酸試劑（DNS）、0.05mol/L檸檬酸緩沖液（pH值5.0）、1%羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液的配制見文獻(xiàn)[6]。

1.4試驗(yàn)方法

（1）原生質(zhì)體單核化：具體過程參見文獻(xiàn)[7]。（2）菌絲生物量的測定：具體過程參見文獻(xiàn)[8]。（3）蛋白含量、漆酶活性的測定：具體過程分別參見文獻(xiàn)[5，9]，其中蛋白含量采用BCA蛋白定量試劑盒測定。（4）纖維素酶活性的測定：具體過程參見文獻(xiàn)[6]。

1.5數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)之間的差異顯著性進(jìn)行分析。

2.結(jié)果與分析

2.1自交45×49和白10的菌絲生長速度和生物量

原生質(zhì)體提取后在顯微鏡下測定濃度100萬～1000萬個(gè)/mL，稀釋后涂板，挑取單個(gè)菌落鏡檢得到121個(gè)單核菌絲。平板對峙試驗(yàn)后，獲得1株菌絲潔白、濃密的菌株，鏡檢有鎖狀聯(lián)合，命名為自交45×49（圖1）。

2.1.1自交45×49和白10的生長速度由圖2可知，自交45×49和白10在平皿上的平均生長速度分別為10.17、10.70mm/d，且二者在0.01水平差異不顯著。由圖3可知，自交45×49和白10在大試管上的平均生長速度分別為3.0、2.81mm/d，且二者在0.01水平差異不顯著。

2.1.2自交45×49和白10的菌絲生物量由圖4可知，自10、自交45×49平均菌絲生物量為0.9、1.58mg/mL，可見自交菌株的菌絲生物量明顯高于退化的白10菌株。

2.2生物酶活性的測定

2.2.1蛋白含量的測定蛋白含量與吸光度的回歸方程為y=0.0016x-0.0083，r²=0.999，蛋白含量在50～400μg/mL范圍內(nèi)，溶液蛋白含量與D562nm呈線性關(guān)系。

2.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸糖含量在0.08～0.56mg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖含量與D540nm呈線性關(guān)系。

2.2.3自10和自交45×49的蛋白含量和酶活力的測定結(jié)果由表1可知，自10的蛋白含量、漆酶活力、濾紙酶活力、羧甲基纖維素酶活力分別為4.5%、25.64U/mg、1.43U/mg、1.23U/mg；自交45×49的相應(yīng)指標(biāo)分別為4.1%、35.03U/mg、1.43U/mg、2.87U/mg。自交菌株發(fā)酵菌絲中的蛋白含量雖然降低了，但是生物酶活力卻相對增強(qiáng)了，其中漆酶活力更是比退化的白10菌株增強(qiáng)了36.62%，可見經(jīng)原生質(zhì)體單核化技術(shù)得到的自交菌株改善了退化菌株的菌絲生長活力，說明原生質(zhì)體單核化技術(shù)在一定程度上可以改善白靈菇菌株的退化現(xiàn)象。

3.結(jié)論與討論

樊曉琳等曾用原生質(zhì)體單核化技術(shù)提純復(fù)壯雙孢蘑菇As2796，并證明原生質(zhì)體單核化技術(shù)提純復(fù)壯菌株是最好的方法；譚琦等利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)，以香菇栽培種Lel和野生種70#為親本，通過原生質(zhì)單核體雜交選育出申香8號，在大面積推廣后成為優(yōu)良菌種；吳小平等將原生質(zhì)體技術(shù)應(yīng)用于靈芝的雜交育種中獲得了24個(gè)優(yōu)良的雜交菌株；江玉姬等將原生質(zhì)體單核化技術(shù)應(yīng)用于金針菇的育種中，證明原生質(zhì)體單核化技術(shù)可為白色金針菇的品種改良提供一個(gè)新途徑。由此可見，原生質(zhì)體單核化技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食用菌育種領(lǐng)域，但是對菌種的提純復(fù)壯還未有更深入的了解。

一般對菌種進(jìn)行提純復(fù)壯采用的都是優(yōu)化培養(yǎng)基法，或是進(jìn)行出菇再組織分離。優(yōu)化培養(yǎng)基法操作簡單、耗費(fèi)時(shí)間短，但是效果不是很明顯；出菇再組織分離法效果明顯，但是周期比較長、過程復(fù)雜。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上采用原生質(zhì)體單核化技術(shù)提純復(fù)壯菌絲可以比更換培養(yǎng)基達(dá)到更好的效果，且比出菇試驗(yàn)簡便，在很大程度上縮短了菌種復(fù)壯周期。

本研究從菌絲形態(tài)、生長速度、菌絲生物量和生物酶活力方面分析了自交45×49和白10菌株的區(qū)別，結(jié)果表明，自交45×49的菌絲生長活力優(yōu)于退化的菌株，證明了原生質(zhì)體單核化技術(shù)在白靈菇菌株提純復(fù)壯中應(yīng)用的可行性。endprint