添加植酸酶對米糠消化酶水解產物化學組成及理化性質的影響

陳練　劉強　張文明　安亞南　周定勇　汪勇　莊蘇

摘要：研究了植酸酶對米糠消化酶水解產物化學組成及理化性質的影響，并探究養分之間的相互作用。結果表明：植酸酶處理顯著增加了米糠液相提取物（sE）的粗蛋白質（cP）和總非淀粉多糖（TNSP）含量（P<0.05），顯著降低了sE的粗灰分（Ash）含量和不可溶剩余物（ISR）的CP、Ash含量（P<0.05）。植酸酶處理顯著提高了sE的Ca、Mn、zn、cu含量和ISR的zn含量（P<0.05），顯著降低了sE的P、植酸磷含量和ISR的P含量（P<0.05）。添加植酸酶顯著增加了sE各單糖含量、單糖總量和ISR的葡萄糖含量（P<0.05）。結果提示，植酸酶處理可提高米糠sE的溶解度、蛋白質含量和非淀粉多糖含量，降低其Ash和植酸含量；米糠中植酸和非淀粉多糖對礦物元素都具有較強的結合能力，它們之間的相互作用可能是導致米糠養分消化利用率較低的重要原因。

關鍵詞：米糠；非淀粉多糖；植酸；蛋白質；礦物元素

中圖分類號：S816.44 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0198-03

米糠是稻谷主要的加工副產物，富含蛋白質、米糠油和維生素等營養物質。我國米糠年產量超過1200萬t，多用于畜禽飼料；但米糠中的非淀粉多糖（non-starchpolysaccha-rides，NSP）含量較高（20%-25%），NSP會阻礙消化酶與細胞內可消化養分的接觸，降低養分的消化利用率。NSP酶可降解細胞壁結構，消除其對養分的包被作用，提高養分的消化利用率和動物的生產性能。目前，以葡聚糖酶和木聚糖酶為主的NSP酶在麥類日糧中已得到廣泛應用并取得了良好的效果，但這類酶制劑在米糠日糧中的效果卻不太理想。鑒于米糠中的植酸和礦物元素含量顯著高于其他谷物加工副產物，而植酸和NSP均能與礦物元素形成復合物，因此推測米糠中多糖、植酸、礦物元素及其形成的復合物是導致米糠消化利用率較低的主要原因。本試驗旨在研究植酸酶處理對米糠消化酶水解產物中不可溶剩余物（insolubleresidue，ISR）和液相提取物（supernatantextract，SE）化學組成和理化性質的影響，探究養分之間的相互作用，為進一步研究米糠細胞壁組成及酶制劑對米糠NSP的降解作用提供試驗材料和依據。

1.材料與方法

1.1材料與主要試劑

新鮮米糠（江蘇禾嘉牧業集團提供），用飼料粉碎機粉碎過40目篩，75℃烘箱中烘干8h，索氏浸提脫脂，保存備用。

主要試劑：耐高溫α-淀粉酶（NovoNodisk，Termamyl120L）、淀粉葡糖苷酶（NovoNodisk，AMG300L）、胃蛋白酶（Signla，77151）、植酸酶（Sigma，P9792）、乙醚（AR）、乙酸（AR）、無水乙醇（AR）、乙酸乙酯（AR）、1-甲基咪唑（signla，336092）、單糖標準品（Supelco，47267）；主要儀器：鼓風干燥箱、分析天平、SHZ-88臺式水浴恒溫振蕩器、pHS-2型酸度計、WH-4漩渦混合儀、日立z-8000原子吸收光譜儀、島津GC-14B氣相色譜儀等。

1.2米糠消化酶水解產物SE和ISR的制備

參考劉強提取NSP的方法并作調整，具體如下：稱取100g脫脂米糠放入燒瓶，加500mL沸水和0.5mL耐高溫α-淀粉酶，旋轉蒸發儀水浴中水解2h（95℃，40r/min）。冷卻至55℃，加入0.5mL淀粉葡糖苷酶，55℃水浴繼續水解8h。冷卻至37℃，將pH值調節為2.0，加入0.5g胃蛋白酶，37℃水浴水解4h。然后4000r/min離心10min，分別收集上清液和沉淀。在上清液中加入4倍體積的無水乙醇，使體系中乙醇體積分數為80%。室溫靜置8h，棄去上清液，收集沉淀并用體積分數85%乙醇溶液洗滌2次，每次靜置20min，棄去上清液，過濾后將沉淀冷凍干燥即為SE1。將離心后的沉淀用去離子水洗滌3次，75℃烘干8h即為ISR1。

1.3米糠消化酶一植酸酶水解產物SE和ISR的制備

該提取方法與消化酶水解法基本相同，僅在淀粉葡糖苷酶水解完成并冷卻至37℃后增加如下步驟：調節pH值至4.5并加入0.2g植酸酶，37℃水浴水解4h（40r/min），其余步驟均同上，由此方法制備SE2和ISR2。

1.4指標測定

參照文獻[4]測定米糠、SE和ISR的水分、粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分含量，淀粉含量測定采用酶水解一DNS法，礦物元素含量測定參照GB/T138852003《動物飼料中鈣、銅、鐵、鎂、鉀、鈉和鋅含量的測定原子吸收光譜法》，植酸磷（phytatephosphorus，PP）含量測定采用三氯化鐵沉淀法，黏度測定參照《中華人民共和國藥典》所述平氏毛細管黏度計法，NSP測定參考Theander等的乙酰醛醇衍生法（Uppsala法）。

1.5數據統計分析

數據以“平均值±標準差（x±s）”表示，采用SPSS18.0統計軟件進行ANOVA單因素方差分析（OIle-wayANOVA，LSD），P<0.05表示差異顯著。

2.結果與分析

2.1米糠SE和ISR的理化性質

SE1為乳白色粉末，質地堅硬；SE2為淺黃色粉末，質地疏松。二者均有一定的黏性和吸濕性。室溫下SE1和SE2在水中的溶解度分別為4.19%和8.60%，SE1溶液呈淡黃色，SE2溶液呈土灰色。SE1和SE2溶液（濃度為1%）在40qC水浴中的相對黏度分別為1.15和1.35。

2.2米糠及其SE和ISR的常規成分

由表1可知，sE中粗灰分相對含量明顯高于米糠，其中SE1中的灰分含量顯著高于SE2（P<0.05），而SE2中的粗蛋白（CP）和總非淀粉多糖（TNSP）含量顯著高于SE1（P<0.05）。ISR中CP和TNSP相對含量明顯高于米糠，與ISR，相比，植酸酶處理顯著降低了ISR2的CP和灰分含量（P<0.05），但對TNSP含量影響不顯著。經2種酶水解后，所得SE和ISR中均未檢測出脂肪和淀粉。endprint

2.3米糠及其SE、ISR的礦物元素含量

由表2可知，米糠中P、Mg、Mn含量較高，其中磷主要以植酸磷的形式存在（占總磷的67.97%），而Ca、Zn、Cu含量較低。SE中礦物元素相對含量均明顯高于米糠，其中Ca、Mn、Zn、Cu含量均高于米糠含量的10倍以上。與SE1相比，植酸酶處理顯著提高了SE2中Ca、Mn、Zn、Cu的含量（P<0.05），降低了總磷和PP的含量（P<0.05），SE2中未檢出PP。除Cu外，ISR中的礦物元素相對含量均明顯低于米糠，其中ISR1和ISR2中均未檢出Mn，ISR2中未檢出PP。植酸酶處理使ISR2中總磷含量顯著低于ISR1（P<0.05），但zn含量顯著升高（P<0.05），其余礦物元素含量未見顯著影響。整體而言，ISR中的礦物元素相對含量均低于SE。

2.4米糠及米糠SE和ISR的單糖含量

由表3可知，米糠中可溶性非淀粉多糖（SNSP）含量較低，僅占米糠TNSP的4.13%，主要由半乳糖和葡萄糖組成；米糠不可溶性非淀粉多糖（INSP）主要由阿拉伯糖和木糖組成，分別占INSP總量的32.99%和45.19%。2種酶水解獲得的SE中單糖組成變化不大，均以阿拉伯糖和半乳糖為主。經植酸酶處理后，SE2中的單糖總糖相對含量顯著高于SEI（P<0.05）。與米糠相同，2種ISR也都以阿拉伯糖和木糖為主，但均未檢出甘露糖。ISR1和ISR2中除甘露糖以外的各單糖含量及單糖總量均顯著高于米糠（P<0.05）。除葡萄糖外，植酸酶處理前后ISR的單糖相對含量變化不大（P>0.05），但ISR2中的葡萄糖含量顯著低于ISR1（P<0.05）。組成sE和ISR的單糖物質的量的比與米糠相比無明顯變化。

3.小結與討論

本試驗獲得的2種米糠液相提取物SE1和SE2的黏度較低，可能與其中結合了較多的礦物元素有關。多糖等大分子聚合物中羥基、羧基和氨基等官能團在水溶液中形成氫鍵或通過范德華力等分子間相互作用是形成黏度的主要原因，礦物離子與上述官能團往往通過配位鍵和離子鍵結合，消除或遮蔽有機大分子組分在溶液中的極性，從而降低其黏滯性。

谷物中的植酸主要分布在胚和糊粉層，其形成跟蛋白質、多糖等物質的沉積有關。研究顯示，稻谷的糠麩層含有大量的植酸和蛋白質，而植酸可與蛋白質形成多元復合物，pH值是影響其復合物形成的主要因素。在酸性條件下（pH值小于蛋白質的等電點），蛋白質末端的α-氨基和蛋白質側鏈的一些基團容易帶正電荷，可與帶負電荷的植酸結合形成二元復合物。而處于中性或堿性條件時（PH值大于蛋白質的等電點），帶負電荷的植酸可通過ca2+、Mg2+、zn2+等二價陽離子的橋鍵作用與帶負電荷的蛋白質結合形成植酸一礦物元素一蛋白質三元復合物。植酸一蛋白質多元復合物的形成，使得蛋白質溶解度降低，進而影響其消化利用率。此外，植酸還可與蛋白酶、淀粉酶等消化酶結合，降低酶的活性，影響蛋白質等養分的消化。本試驗中，植酸酶處理使sE中蛋白質含量增加而IStl中的蛋白質含量降低，即增加了可溶性蛋白的含量。植酸酶可破壞植酸一蛋白質多元復合物，釋放植酸結合的蛋白質，從而促進蛋白質的消化利用。zi等研究表明，在豆粕中添加0.5%植酸酶使得豆粕蛋白質的水解度由0.22moI/kg增加至1.26mol/kg。Kong等在肉雞日糧中添加植酸酶（1500U/kg），發現植酸酶對肉雞的蛋白質效率（8-15d）和蛋白質沉積量（15～22d）有顯著的影響。此外，Zeng等的研究也證實，在斷奶仔豬低磷日糧中添加植酸酶能顯著提高日糧亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和半胱氨酸的表觀消化率。

米糠中富含礦物元素，然而單胃動物對米糠中的礦物元素利用率較低。日糧纖維和植酸是影響米糠中礦物元素消化利用的主要因素。植酸的磷酸基團帶負電荷，在一定條件下能與二價陽離子結合形成結構穩定、難以溶解的植酸鹽，降低礦物元素的消化利用率。植酸酶的作用可破壞植酸一礦物元素復合物，釋放出礦物離子，進而提高礦物元素的利用率。Madrid等研究表明，在生長豬低磷日糧中添加植酸酶能顯著增加Ca、P、Mg、Cu的消化率，顯著增加P、Mg、Cu的沉積率。Bikker等也研究了添加植酸酶對Zn和Cu在豬體內消化率的影響，結果表明，植酸酶能顯著增加Zn的消化率，但對cu的消化率無顯著影響。不同礦物離子與植酸結合的能力不同，一般來說Zn2+>cu2+>Ca2+，隨著二者結合能力的減弱，其形成的植酸鹽的穩定性降低，因而植酸酶對cu的作用小于對zn的作用。本試驗添加植酸酶使得可溶性ca、Mn、Zn、Cu含量顯著升高，與Madrid等、Bikker等的結果較一致。然而本試驗中P、Mg的含量呈現下降趨勢卻較為反常，這可能跟米糠細胞壁復雜的多糖結構有關。此外，反應體系的pH值、礦物元素的種類、植酸與礦物離子的物質的量之比、其他螯合劑的競爭作用都有可能影響植酸與礦物元素的結合導致結果異常。

植酸不但能直接結合谷物中的礦物元素，還可與NSP發生交互作用絡合形成多糖一植酸一礦物元素多元聚合物，影響日糧中礦物元素的利用。Pushpanjali等研究發現，日糧纖維能抑制Zn、Fe等礦物元素在體內的吸收和沉積，礦物元素的利用率與日糧中植酸和纖維的含量呈顯著負相關。也有研究表明多糖可以直接與礦物元素結合形成多糖一礦物元素復合物。Wang等研究表明，纖維素酶可以提高米糠中Ca的體外溶解率，推測纖維素可能與ca結合形成難溶的復合物。張亞偉的研究也證實，日糧中的Gal與結合態的Cu顯著正相關，小腸食糜中的不溶性的Ara、Xyl與結合態的zn、Mn顯著正相關。本試驗結果顯示，經過植酸酶處理的SE中各單糖殘基和總的多糖含量均顯著增加，可能是植酸酶降解了復合物中的植酸，破壞植酸與多糖的相互作用，釋放出與植酸結合的多糖。從整體來看，sE中的礦物元素和植酸磷的含量均明顯高于ISR，表明SE與植酸和礦物元素的結合率顯著高于ISR，因此推斷米糠中的sE和植酸鹽可能是影響其礦物元素利用的主要因素。endprint