南美白對蝦肝胰腺超氧化物歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測

劉莉等

摘要：試驗設計了南美白對蝦超氧岐化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測的特異性引物，用于檢測肝胰腺中超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）的表達。該方法避免了血清學檢測免疫指標的不穩定性、測定值波動性較大的缺點，可作為評估南美白對蝦免疫狀態的一種分子檢測方法。

關鍵詞：南美白對蝦；肝胰腺；SOD；PO；熒光定量PCR

中圖分類號： S945.4+9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0290-02

南美白對蝦屬甲殼類動物，其免疫主要為非特異性免疫。包括體液免疫中的一些非特異性的酶或因子來進行的[1-2]。抗氧化酶是無脊椎動物機體非特異性免疫的一個重要方面，其中SOD是一種能夠催化超氧化物通過歧化反應轉化為O2和H2O2的酶。超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化系統中起關鍵作用的酶，不僅具有清除體內自由基的作用，而且在機體免疫調節中具有重要的作用[3-4]。酚氧化酶（PO）是一種含銅的氧化還原酶，能夠催化單酚羥化成二酚，再把二酚氧化成醌，醌在非酶促條件下形成反應終產物黑色素。其反應鏈的短暫中間產物擁有很高的生物毒性，能夠抑制病原體胞外蛋白酶以及幾丁質酶的活性，屬于一種酶級聯反應系統，在南美白對蝦抵抗病原菌侵襲過程中具有重要作用[5-9]。

目前檢測南美白對蝦免疫活性因子通常是通過采集血清，采用生化反應方法檢測免疫相關酶。由于采集過程及檢測過程，酶活性極易受外界環境的影響，常導致檢測結果波動性很大，檢測的可靠性受影響。酶的產生是通過基因的轉錄、翻譯及后加工形成的，其轉錄水平也可反映機體的免疫狀態。蝦肝胰腺是其血細胞產生的主要場所，肝胰腺組織免疫因子的轉錄表達也可作為評價機體免疫能力的指標之一。熒光定量PCR檢測技術已經成為國際上檢測基因表達通用的方法，能對低豐度mRNA水平進行定量分析[10]。設計特異性強的引物以及合適的反應條件是利用熒光定量PCR檢測南美白對蝦免疫相關因子的關鍵。本發明設計的引物及反應條件可同時用于檢測南美白對蝦肝胰腺SOD和PO的轉錄相對定量表達檢測，為今后準確分析其南美白對蝦免疫狀態提供新的方法。

1材料與方法

1.1材料

南美白對蝦來自浙江省紹興縣某養殖場，SYBGreen反應預混液購自Bio-Rad公司，M-MLV酶、dNTP、RNase抑制劑購自TaKaRa（大連）公司，Trizol購自Invotrigen公司。

1.2肝胰腺總 RNA的提取

取南美白對蝦完整肝胰腺組織，加入500 μL Trizol裂解液，用研磨棒研磨，等徹底勻漿后，取50 μL勻漿液加入1 mL Trizol 繼續裂解5 min。其余勻漿液置-80 ℃保存備用，或將完整肝胰腺在液氮中速凍后置于于-80 ℃下保存。使用時將組織全部碾磨后，取100 mg加入1 mL Trizol裂解，其余組織粉末置-80 ℃保存備用。

取出的50 μL勻漿液或100 mg組織粉末繼續裂解5 min后，12 000 r/min條件下離心2 min，吸取上清至新的離心管。加入200 μL三氯甲烷，渦旋混勻，12 000 r/min條件下離心15 min，吸取上清。加入等體積異丙醇，顛倒混勻數次，靜置10 min，12 000 r/min 條件下離心10 min，棄上清。用500 μL DEPC水配制的70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min 條件下離心 5 min，棄去上清。100 μL DEPC水溶解RNA。 測定RNA濃度和純度后，-80 ℃保存備用。

1.3引物設計與合成

引物是根據GenBank公布的南美白對蝦SOD（登錄號：AY486424.1）、PO（登錄號：JN393011.1）及β-actin內參基因序列（登錄號：JF288784.1），由軟件Primer Premier 5.0設計和手工修改后獲得（表1），均由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

1.4cDNA合成

取1 μg 總RNA為模板，加入1 μL 10 mmol/L dNTP、1 μL 50 mmol/L Oligo（dT）15，加DEPC水至總體積6.25 μL，65 ℃變性5 min，冰上驟冷2 min。上述反應液加入2 μL 5× M-MLV buffer、0.25 μL RNA酶抑制劑、0.5 μL MMLV逆轉錄酶、1 μL 10 mmol/L二硫蘇糖醇，使最終反應總體積達 10 μL。42 ℃反應1 h后，65 ℃孵育10 min，cDNA合成完畢。表1熒光定量PCR所用引物

檢測基因名稱引物序列（5′→3′）擴增長度（bp）SOD SOD-F：CGCCCTTGAACCTCACATCT；SOD-R：ATTGCGCTTACGTCATTGGC135POPO-F：AATGACCGCGTTGAGGAGTT；PO-R：AGTGGGATCTTCAGCTTGCC134β-actin（內參）β-actin-F：CGAGCGAGAAATCGTTCGTG；β-actin-R：GAATGAGGGCTGGAACAGGG187

合成的cDNA加入90 μL無菌雙蒸水，用于后續熒光定量PCR擴增。1.5熒光定量的反應體系及條件

取5 μL上述合成的cDNA稀釋液作為擴增模板，加入2×Sybgreen反應預混液12.5 μL，分別加入5 μmol/L相應特異性上、下游引物各0.5 μL，加6.5 μL無菌雙蒸水，使反應總體系達25 μL，置于熒光定量PCR儀上進行PCR反應。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；60～90 ℃熔解曲線。

2結果與分析

2.1熒光定量PCR擴增效果

從擴增曲線可以看出，SOD、PO及內參基因β-actin的擴增曲線均較好，曲線拐點清楚，基線平，無上揚現象；SOD的CT值為23.85，PO的CT值為28.33，能較好地反映各基因的表達差異（圖1）。通過CT值計算該樣品中SOD和PO表達量相對于β-actin的表達量分別為0.140 63、0.006 30倍。

2.2熒光定量PCR擴增產物的熔解曲線

從擴增產物的熔解曲線看，SOD、PO及內參基因β-actin均為單峰，且峰值較高（圖2），表明各擴增產物的特異性較好，且擴增效率較高。

2.3熒光定量PCR擴增產物的瓊脂糖電泳檢測

將熒光定量PCR的擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測，結果顯示SOD、PO及內參基因β-actin的各擴增產物的條帶單一，亮度較好，并能一定程度上看出各基因的表達差異（圖3）。進一步證實了其較好的擴增效率和較高的擴增特異性。

3結論與討論

非特異性免疫因子的測定是評估南美白對蝦免疫狀態的主要指標，建立可靠的檢測方法對于南美白對蝦的免疫學研究、抗病育種研究等都具有重要意義。傳統的體液免疫指標的測定常采用酶法檢測，但易受多種因素干擾，測定值偏差較大。近幾年，隨著分子生物學迅猛發展，熒光定量PCR方法開始被廣泛應用于多種免疫因子定量檢測[11-12]。熒光定量PCR檢測方法的可靠性與所設計引物的特異性和擴增有效性密切相關。本方法針對SOD和PO等2個重要的非特異免疫指標設計了特異性較好、擴增效率較高的引物，建立了利用熒光定量PCR方法對南美白對蝦肝胰腺SOD、PO的檢測方法。該方法特異性強，敏感性高，克服了酶法測定易波動的問題，適合南美白對蝦免疫活力的評估。

與酶法檢測技術比較，本方法所提供的南美白對蝦肝胰腺SOD、PO的熒光定量PCR檢測方法具有以下優點：（1）所采用的肝胰腺組織較對蝦血液采集更容易。（2）所采集的組織直接用Trizol處理或通過速凍方式保存，可有效減少RNA降解；較血清采集過程可能發生的溶血或其他導致酶失活的因素更易于控制，保證結果的可靠性。（3）設計的引物特異性好，擴增效率高，提高了檢測的準確性。（4）采用相對定量方式，通過與內參基因表達量的對比，可同時測定多個免疫相關因子。

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