病原性細菌檢測方法的研究進展

謝鵬等

摘要：細菌檢測對于監控食品衛生安全具有舉足輕重的作用。隨著技術的發展，傳統生化方法和分子生物學技術在細菌檢測上都經歷了重大的革新，二者都朝著更加精確、高效的方向上發展，如全自動微生物生化檢測系統、PCR技術等都在研究檢測機構得到了廣泛應用。本文介紹了病原性細菌檢測的傳統生化和分子生物學方法，分析了各種方法的優缺點，為具備不同基礎條件的各級檢測部門和研究機構開展病原性細菌檢測提供一定的參考。

關鍵詞：病原性細菌；檢測方法；生化方法；分子生物學方法；優缺點

中圖分類號： Q5-3；S852.61文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0253-03

隨著我國社會經濟的發展和人民生活水平的提高，人們對肉、蛋、奶等畜禽以及果蔬類產品的需求量越來越大，與此同時，對食品的質量要求也日益提高。然而，由于我國農業生產大部分仍以中小散戶為主，農產品來源廣泛，生產過程中存在原料控制不嚴、用水污染、設施落后等因素，極易在生產前端染菌；此外，在農產品的后期加工與流通中，也同樣容易造成食品的細菌污染。根據溫州、長沙、南通等多地區研究機構和疾病預防控制中心報道，當地生豬、雞、牛、羊肉、水產品、熟肉制品以及水果蔬菜中均能檢測出致病性較強的病原菌，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等[1-3]。由此可見，我國農產品細菌污染較為嚴重，檢測病原性細菌是食源性疾病預防和控制的關鍵環節，對維護消費者的健康具有重要意義。本文綜述了對細菌檢測方法的研究進展情況，為具備不同基礎條件的各級檢測部門和研究機構提供一定的參考。

1常規生化方法在細菌檢測上的應用

1.1培養基法

為監控食品衛生安全，我國進出口商檢局和衛生部經過多次修訂并制定了針對農產品中致病性細菌檢測的一系列標準，如檢測腸桿科細菌（Enterobacteriaceae）的行業標準SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗方法》以及檢測金黃色葡萄球（Staphylococcus aureus）的國家標準GB/T4789.10—2010《食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》。幾乎所有的標準均以傳統的細菌培養方法為基礎，包括前增菌、分離培養、結合生化及血清學試驗進行判定，其優點在于設備要求不高，檢測成本低，以生長菌落數作為判定結果可準確定量，重復性強；但其步驟繁瑣，工作量大，報告結果通常需要5～7 d，因此過長的檢驗時間易使得生產部門延誤時間，無法應對緊急情況。

1.2快速檢測試紙片法

目前商品化的細菌試紙片多將特定培養基和顯色物質附著在紙片、凝膠或膠片等載體物質上，通過微生物的生長與顯色達到快速檢測微生物的目的[4]。由于與常規培養法相比省卻了復雜的準備工作，操作簡便，節省時間，因而已開始被廣泛應用。其中以美國3M公司生產的Peterifilm系列紙片最具代表性，李寧采用該公司生產的試紙片測定食品、空氣中沉降菌以及硬表面菌落總數，結果發現使用紙片法在培養24 h即可觀察計數，且在硬表面菌落總數測試中，試紙片法表現出較高的靈敏度，優于國標檢測法[5]。而陳春田等認為與傳統培養方法相比，試紙片法并不能節約培養時間，且靈敏度較低，雖能簡化操作步驟，但易出現假陰性結果[6]。筆者認為試紙片產品質量可能是影響檢測結果的重要因素之一。此外，由于膠體金試紙具有方便快捷、特異性強、敏感度高等特點，通過制備目的細菌的單克隆或多克隆抗體，將其標記膠體金，制成的免疫層析試紙對于檢測某些特定病原菌如金黃色葡萄球菌、李斯特菌等在近年來也得到了廣泛應用[7-8]。

1.3全自動微生物生化鑒定系統

全自動微生物生化鑒定系統是一種集生化反應、計算機和自動化技術于一體，運用概率最大近似值模型法進行微生物檢測的技術。各種微生物對不同底物生化反應的不同是該系統鑒定的基礎，其鑒定結果的精確度取決于鑒定系統配套培養基的種類、配制方法、濃度、孵育條件和結果判定標準等。如法國生物梅里埃公司的VITEK系統和美國BD公司的PHOENIX系統，該自動化系統可進行多達幾十種的微量生化反應和藥敏生長試驗，根據各生化反應孔中的生長變化及呈色反應情況，由計算機通過數值編碼技術與數據庫進行比較分析，得到鑒定結果[9]。范義等應用VITEK-2系統檢測食源性病原菌沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌和副溶血性弧菌，并與國標GB/T 4789—2003《食品衛生微生物學檢驗》中的方法比較，結果顯示符合率為100%，且應用該系統可縮短檢測時間6～36 h[10]。王原等認為應用BD PHOENIX-100系統可基本上滿足臨床上檢測金黃色葡萄球的需要，但在進行凝固酶陰性葡萄球菌鑒定時存在一定的局限性[11]。由于全自動微生物生化鑒定系統能同時對多個樣品進行分析，鑒定時間短、速度快、易操作，且檢測菌種范圍廣，因而具有很高的應用價值。

2分子生物學技術在細菌檢測上的應用

近30年來，分子生物學技術發展迅猛，人們對微生物的研究也逐漸從外部表型轉向內部基因結構特征，基于物種遺傳物質多樣性和保守型并存的理論前提，在核酸水平上進行微生物的分類鑒定及定量檢測已成為一個重要的發展方向，傳統的以培養為基礎的診斷技術將逐步被更先進的分子診斷方法取代[12]。

2.1核酸擴增法

2.1.1聚合酶鏈式反應（PCR）法由于PCR擴增特異性好、操作簡單、耗時短，因而在實驗室和臨床快速檢測病原菌中得到了廣泛應用。Wang等將PCR技術應用于食品中單核細胞增生李斯特菌的檢測，結果發現PCR法對13株單核細胞增生李斯特菌呈陽性，而對其他23種細菌皆呈陰性，說明該方法具有較高的特異性[13]。Rahn于1992年建立了沙門氏菌檢測的PCR方法，該方法基于擴增毒力島SP11關鍵因子之一的invA基因，特異性良好[14]。Matsuki等設計了針對腸道脆弱擬桿菌、雙歧桿菌等4種菌株的特異性引物，對300株菌株進行PCR擴增，結果發現74%的菌株能夠特異性擴增出來，而未被擴增出來的菌株為其他種類細菌[15]。但是，另一方面，由于PCR得到的擴增產物并不能反映樣本中細菌的真實含量，因而無法形成統一的標準進行衡量，且在核酸抽提和擴增過程中存在一定偏差和效率的不同，可能會降低信息的精確度；但PCR法檢測細菌從樣本采集到結果判定僅需6～8 h，與傳統的培養基法相比，大大縮短了檢測時間[16]，因而在某些基因序列并不保守的細菌檢測上，具有無可比擬的優勢。

2.1.2環介導等溫擴增（LAMP）法LAMP法是日本學者Notomi等于2000年建立的，屬于核酸擴增技術的一種，它通過針對靶基因的6個區域設計4種特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下短時間內可擴增出大量拷貝[17]。該方法在操作上無需變性步驟，因而對設備的要求不高，簡化后的LAMP法擴增出的產物甚至不需要借助儀器即可即時觀察，這對于分子生物學技術在基層以及取樣現場的使用具有重要意義。唐夢君等建立了金黃色葡萄球菌的LAMP快速檢測法，65 ℃等溫條件下僅45 min即可擴增出梯形條帶，檢測結果與國標方法符合[18]。姜侃等設計了針對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌高保守基因序列的LAMP引物，建立了三重LAMP檢測方法，在90 min內一次性檢出上述3種細菌，且特異性高，檢測靈敏度是PCR方法的1 000倍[19]。LAMP方法成為食品衛生領域致病菌檢測的潛在有效手段之一，但是也正因其高靈敏性、產物量巨大的特點而導致開蓋檢測易形成氣溶膠污染，從而造成假陽性結果的出現，因此在實際操作中應嚴格避免交叉污染，同時LAMP的不開蓋檢測應是未來進一步簡化步驟并保證結果重復性高的研究重點[20]。

2.2核酸探針雜交法

核酸探針雜交技術是指利用核酸變性和復性的原理，使得帶有標記物的已知序列的核酸片段，和與其互補的核酸序列雜交形成雙鏈，因而能用于樣品中特定基因序列的檢測。

2.2.1印跡雜交法Southern、Northern和斑點印跡雜交法在核酸技術發展早期應用非常廣泛，Greisen等針對能夠引起腦膜炎的腦膜炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌等設計了一系列特異性探針，采用印跡雜交技術成功檢測出病患腦脊髓液樣本中的目的細菌[21]。Lin等用 32P標記了沙門氏菌的3種寡核苷酸探針，采用Southern印跡顯影，比較了3種探針的特異性，并優化了食品中沙門氏菌的鑒定體系[22]。AOAC990.13GENE-TRAK 沙門氏菌檢測、AOAC993.09 GENE-TRAK李斯特氏菌檢測均采用了核酸探針技術。應用印跡雜交技術的核酸探針方法靈敏性較高，特異性強，而不受非目的細菌的影響，尤其是對尚不能分離培養的細菌檢測有特殊意義，具有良好的定性作用，但缺點是無法確切定量。

2.2.2與熒光顯微鏡聯用法早期的放射性同位素標記由于其易造成放射性污染已逐步由非放射性標記物替代。采用不同熒光素標記的特異性核酸探針與細菌進行雜交，不同散射光和發射光波長的熒光素可使各種被標記的目的細菌在熒光顯微鏡下顯示出不同顏色，選擇一定數量的視野進行統計即可計量細菌總數。研究人員應用目標細菌的特異性核酸探針與細菌通用探針EUB338或DNA染料進行雙標，從而在熒光顯微鏡下可以對目標細菌進行定性和定量。目前該方法尚未大量應用于食品與醫學檢測，Krimmer等用Cy3標記的核酸探針從生物膜中成功檢測出金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，并認為其適用于臨床檢測[23]。在用16S rRNA序列設計特異性探針分析人的糞便中特定細菌數量變化發現，雙歧桿菌在正常體重兒童排泄物種的含量要高于超重兒童，而隨著年齡的增長，奇異菌屬的多樣性提高了[24-25]。由于通常情況下為保證統計結果的準確性，操作人員需要選擇多達數十個視野進行分析，這無疑增加了工作量，降低了效率。

2.2.3與流式細胞儀聯用法流式細胞術是一種能夠在單細胞或其他生物粒子水平上進行理化、免疫及分子生物學性狀及功能方面多參數分析檢測的現代分析技術，它可以高速分析上萬個細胞，具有速度快、精度高、準確性好等優點，成為當代最先進的細胞定量分析技術。以核酸探針進行的熒光原位雜交技術與流式細胞儀的結合（FISH-FCM）使用最初應用于分析活性淤泥和海水樣品中目標細菌及菌群的數量變化，而后研究人員逐漸將該項技術引入醫學研究，姜云濤等應用細菌通用探針EUB388和變形鏈球菌特異性探針MUT590成功檢測了主要致齲菌變形鏈球菌[26]；Xie等將該法用于動物營養學上的研究，發現隨著攝食脂肪飽和度的降低，腸桿菌科細菌、梭菌、科里氏桿菌占鴿子腸道細菌總數的比例逐漸降低[27]。FISH-FCM方法特異性強，且能夠真實反映自然環境下微生物數量與空間分布等方面的信息，在一個檢測步驟中，可同時處理多條目標序列。我們相信FISH-FCM對于食品中致病性微生物的檢測，應該存在較強的可行性。

2.3基因芯片技術

基于PCR與核酸探針雜交技術相結合的基因芯片技術于20世紀90年代即開始用于細菌的鑒定，細菌樣品DNA經PCR擴增后，通過制備的熒光標記核酸探針與芯片上的寡核苷酸點雜交，經掃描儀定量并分析熒光分布模式來確定檢測樣本中的特定細菌是否存在。由于基因芯片技術同時將大量探針固定于支持物上，因此可一次性對樣品大量序列進行分析和檢測，具有多樣品并行處理能力，解決了傳統核酸印跡雜交技術操作序列數量少的特點，且所需樣品量少，污染小[28]，基因芯片技術已用于臨床細菌混合感染、耐藥菌及毒力的檢測，為醫學上指導臨床治療，藥物篩選帶來深遠影響[29-31]；但由于其制作成本高、技術復雜、檢測靈敏性有待于提高等缺陷，因而目前在食品衛生領域應用較少。

3結語

綜上所述，雖然分子生物學技術在致病菌定性與定量上將會是未來發展的主要方向，但是包括傳統培養法在內的生化分析檢測依然在成本和可操作性上具有一定的優勢，而且今后將會朝著更加快速精確的方向發展。目前各級研究機構和衛生檢測部門的基礎條件不同，因此在一定程度上，2類方法的結合使用是確保檢測工作準確進行的有效途徑。

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