基于液相色譜—串聯質譜法分析茉莉酸與果梅休眠的關系

韓馳　仲文君　高志紅　霍希美　李百健　莊維兵　倪照君

摘要：建立了不同果梅（Prunus mumeSieb.etZuee）品種4個休眠時期花芽的茉莉酸（jasnlonieacid）含量的液相色譜一串聯質譜（1iquidchrom atography-tandemtriplequadrupolemassspeetronletrie，LC-MS/MS）測定方法。樣品經過甲醇提取，Agela CleanertSPE-NH2固相萃取小柱凈化。色譜分離采用c、。反相柱，以乙腈一水（水相含0.05%乙酸）為流動相梯度洗脫，質譜分析采用ESI離子源、二級串聯質譜、負離子模式下進行檢測。測定結果，方法標準曲線線性良好，茉莉酸r=0.9992，平均回收率范圍為78.18%～97.49%，相對標準偏差（RSD，n=3）為1.25%～8.27%。該方法操作簡便，靈敏度高，選擇性好，回收率高，適合果梅花芽中茉莉酸的測定。結果表明，被測2個品種的果梅花芽中，休眠解除和生態休眠時期的茉莉酸含量高于內休眠和抑制性休眠時期，推測內源激素茉莉酸可能有抑制果梅休眠和促進花芽正常生長的作用。本試驗對進一步探討果梅休眠與內源激素茉莉酸的關系打下了一定的基礎。

關鍵詞：液相色譜一串聯質譜；果梅；休眠；茉莉酸

中圖分類號：O657.63 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0167-04

季節性休眠包括抑制性休眠、內休眠和生態休眠3種類型，其中內休眠又稱為自然休眠。果樹在休眠過程中受到環境因素尤其是光周期和溫度的影響啟動了一系列的生理生化反應，涉及到植物激素、信號物質和多基因的表達和調控。芽的休眠由內源激素控制，休眠的起始、終止均受激素調節，環境因素（外部信號）也通過影響激素（內部信號）的合成和運輸來影響休眠進程而改變低溫需求量。通常認為，休眠是由內源激素赤霉素、脫落酸、生長素和乙烯中的促進生長物質和抑制生長物質之間平衡狀態決定。近期研究報道植物休眠與生長過程中也相繼發現了與茉莉酸代謝相關的基因。

茉莉酸類化合物在植物中具有多方面調節功能：（1）信號傳導作用。如在植物創傷、脅迫、病蟲害過程中，茉莉酸作為一種信號物質在植物體內傳遞生物或非生物脅迫的信號。（2）生理作用。如調節呼吸作用、花粉的發育、乙烯生物合成、果實的成熟、植物的光合作用和色素的形成、植物根系和植抹的生長，以及植物次生代謝的調節等。（3）基因的調控作用。如茉莉酸生物合成和茉莉酸信號通路相關的AOS、AOC、OPR3、JMT、LOX2，以及JAZs、COH、MYC2等基因都可能受茉莉酸的調控。液質聯用技術作為一種新型的現代儀器分析手段，因其高靈敏性、高準確性、高選擇性、分析檢測范圍寬、時間短以及定性定量方面的強大功能等特點，在分析檢測領域得到了廣泛的應用。本研究通過液質聯用方法來測定果梅不同休眠時期花芽內的茉莉酸含量，以期明確果梅休眠與內源激素茉莉酸的關系。

1.材料與方法

1.1儀器與試劑

安捷倫1260液相色譜一（6530系列三級四級桿飛行時間質譜聯用儀、Eppendorf/Centrifuge5810R冷凍離心機、真空冷凍干燥機（中國北京博醫康實驗儀器有限公司生產）、氮吹儀（美國OrganomationAssociates公司生產）、高能量磨樣儀等。

二氫茉莉酸（dihydrojasmonicacid）購于TCI公司，茉莉酸購于Sigma公司，均為色譜級，產品純度>98%。甲醇、乙睛：色譜純，德國Merck公司產品，二氯甲烷（色譜級），乙酸（色譜級），市售純凈水（娃哈哈）。

1.2試驗材料

供試材料為果梅品種桃形梅、豐后，均采自南京農業大學國家果梅種質資源圃。桃形梅為低需冷量的果梅品種，而豐后為高需冷量品種。分別采取不同果梅品種4個休眠時期的花芽，即抑制性休眠（A）、內休眠（B）、生態休眠（c）、休眠解除（D）4個時期。每個品種的花芽分別采于3棵對應品種的樹上。采樣日期的確定根據不同品種的需冷量和各自物候特征決定。在葉片脫落之前，花芽處于抑制性休眠階段；等待葉片脫落之后，剪取長勢正常的枝條若干用5%蔗糖水放于光照培養箱中，測定萌發率。光照培養箱保持70%的相對濕度，溫度為（25±1）℃，光一暗周期16h一8h。蔗糖溶液和新鮮的枝條每3d更換1次，當芽尖端冒出綠色萼片時，即認為萌發了。研究結果，果梅花芽的萌發率與其需冷量呈正相關（r=0.9797）。光照培養箱中枝條的萌芽率小于50%時，此期間采取的花芽被認為處于內休眠階段；當萌芽率大于50%時，則處于生態休眠階段。在大田中正常生長的花芽萌發率達到50%時，此階段采取的花芽則處于休眠解除階段。

1.3樣品處理

1.3.1茉莉酸提取稱取0.1g果梅花芽并加入400ng二氫茉莉酸作為內標物裝在2mL離心管中，樣品經液氮冷凍磨成細粉末。用800bL80%冷甲醇提取3次，每次渦旋10min，4℃12000r/min離心10min，收集上層液。氮吹濃縮蒸發至水相，用2mol/L的HCI調pH值至2.5～3.0。用等體積乙酸乙酯萃取3次，每次渦旋10min，4℃12000r/min離心10min，吸取上層有機相到同一管中，氮氣吹干，待進一步純化。

1.3.2純化提取步驟中的蒸干樣品用1mL二氯甲烷/甲醇（V：V=99：1）溶解淋洗離3次，并將同一重復的2份樣品溶解收集到同一管中。純化用Agela Cleanert SPE—NH2（500mg/6mL）固相萃取小柱。小柱用前用6mL二氯甲烷一甲醇（V：v=99：1）活化。全部6mL樣品上柱，棄去過柱廢液，用3ml二氯甲烷一甲醇（v：V=99：1）淋洗柱子，棄去淋洗液。用2%的乙酸甲醇溶液分3次洗脫，第1次用4mL，第2、第3次用3mL，用干凈的離心管收集洗脫液。洗脫液真空冷凍至干，用0.3mL的0.05%乙酸水溶液一乙睛（V：V=80：20）溶解，再用0.22μm微孔膜過濾，收集濾液-20℃條件下保存備用。待測樣品分別標號桃形梅A、桃形梅B、桃形梅c、桃形梅D、豐后A、豐后B、豐后c、豐后D，每個樣品設置3份重復。

1.4LC-MS條件

1.4.1色譜條件色譜柱C18（2.1×50innl，1.8μm，B型全多孔，安捷倫）；柱溫40qC；流動相A1：O.1%甲酸水，流動相B1：甲醇；流動相A2：0.05%乙酸水，流動相B2：乙睛。在已建立的質譜條件下改變流動相的配比和流速優化目標物分離的線性梯度洗脫程序。

1.4.2質譜條件對茉莉酸和二氫茉莉酸標準品進行質譜掃描，確定其母離子與子離子。優化毛細管出口電壓、碰撞氣能量、干燥氣溫度、干燥氣流速、噴霧壓力等條件，確定其特征離子，選擇相對強度大、信號穩定的碎片離子作為檢測離子。

1.5標準曲線的繪制

準確配制0.75、1.25、2.50、5.00、10.00ng/μL的茉莉酸標準系列溶液，進行儀器分析，以峰面積（_v）對濃度（x）繪制標準曲線。以保留時間、茉莉酸和二氫茉莉酸的母離子與子離子定性，以內標法定量。

2.結果與分析

2.1色譜條件的建立

色譜檢測時，最初5inn的洗脫液排入廢液池（防止對MS離子源帶來背景干擾和非揮發性的鹽污染質譜儀）；流速0.4mL/min；檢測器DND，進樣量為10μL。因為流動相的組成對LC-MS/MS測定的信號強度會產生很大的影響，我們對比了2種流動相對于色譜行為的影響。結果表明，流動相A2：0.05%乙酸水，流動相B2：乙睛，出的峰更好，所以選擇了第2種流動相為測定花芽中的茉莉酸含量。并且優化了梯度洗脫程序（表1）。

2.2質譜條件的確定

為了消除復雜基質對檢測器靈敏度的影響，采用串聯質譜（MS/MS）的多反應監測（MRM）技術，目標物經過液相色譜柱分離后，經過一級質譜對相對分子質量進行篩選，電離后經過二級質譜對離子進行篩選，從而提高了被分析物的信噪比，去除了共流出物的干擾，最大限度地排除雜質背景，顯著提高實際樣品的靈敏度和定量分析的準確性。質譜條件見表2。

2.3

回歸方程及樣品的液相質譜特征

該方法所得茉莉酸的回歸方程為y=44815.50x+14125.83，r=0.9992，二氫茉莉酸的回歸方程為y=54299.44x+165045.08，r=0.9994，呈較好的線性關系。從圖1-a可見，茉莉酸的出峰時間為4.8min，其質譜圖見圖1-b。從圖2-a可見，內標二氫茉莉酸的出峰時間為5.7min，其質譜圖見圖2-b。

2.4精密度與準確度試驗

在桃形梅A、B、C、D和豐后A、B、C、D樣品中，分別加入茉莉酸標樣10.0ng。按前述方法測定茉莉酸含量，重復3次，計算回收率結果見表3。

從表3可以看出，該方法的平均回收率范圍為78.18%～97.49%，RSD為1.25%～8.27%。

2.5樣品的測定

運用LC-MS/MS法對2個品種不同休眠時期的花芽分別進行檢測，茉莉酸含量結果分析見圖3、圖4。

3.討論

茉莉酸在植物界中普遍存在，廣泛分布于植物的幼嫩組織、花和發育的生殖器官中，通過信號轉導途徑調控植物生長發育和應激反應。隨著研究的深入，茉莉酸的生物學作用越來越受關注。本研究通過測定不同品種果梅的花芽中茉莉酸的含量，初步探索果梅4個休眠時期與茉莉酸含量的內在聯系。

2個品種間，茉莉酸在抑制性休眠和內休眠時期含量偏低，而在生態休眠期茉莉酸含量明顯高于內休眠時期的。這一現象得出茉莉酸的合成在抑制性休眠和內休眠時期被抑制，推測茉莉酸對果梅的休眠可能有抑制作用。茉莉酸與植物的發育密切相關，如種子的萌發和生長、貯藏蛋白的積累等。而生長停止是植物進入休眠的前提條件，也是多年生植物抵御冬季低溫的機制之一。所以在抑制性休眠和內休眠時期，茉莉酸的含量偏低，則不利于植物的生長與相關蛋白等的積累，但有利于植物休眠的順利進行。

生態休眠是植物休眠經歷的第三個階段，它是由于外界不利的生長條件而造成，如干旱或低溫等。一旦外界條件合適，植物可以很快恢復生長，而內休眠即使條件合適也不會恢復生長，必須滿足其需冷量后才能在適宜條件下生長。本試驗中，供試的2個果梅品種花芽在生態休眠時期的茉莉酸含量比抑制性休眠和內休眠時期有所增加。zhong等在數字基因表達譜研究中也發現茉莉酸相關基因在生態休眠期間的表達量高于內休眠時期的。茉莉酸含量的增大有利于花芽在生態休眠期間貯存蛋白積累，為促進花芽萌發做準備。在花的發育過程中，茉莉酸含量多少也與花粉育性有關。生態休眠期間，茉莉酸含量明顯增加另有一種解釋，也有可能與果梅自身的防御系統相關。生態休眠本就是由于外界不利的生長條件所造成，植物在遭遇不利環境因子脅迫時，自身增大了茉莉酸的合成量，加強了茉莉酸在信號轉導中的信使作用，并誘導一系列植物防御基因的表達、防御反應化學物質的合成等，從而調節植物的免疫和應激反應。相關研究表明，茉莉酸合成途徑的激活對于應激信號的傳遞和放大是必不可少的。

從本試驗結果可以看出，桃形梅和豐后花芽內的茉莉酸含量，在休眠解除時期明顯高于生態休眠時期。休眠解除，果樹正常生長，生理反應開始活躍，茉莉酸合成也大大增加。同時也說明茉莉酸合成相關基因在前3個休眠時期可能被某種程度抑制了。相關報道指出，茉莉酸可以激活乙烯相關基因來調控休眠，乙烯合成在休眠期間也是被抑制的，表明茉莉酸在調控果梅休眠進程上作用于乙烯存在著密切的關聯。這需要進一步研究闡述。

植物體內的激素代謝途徑是相互交聯的復雜網絡。基于2個果梅品種花芽的茉莉酸含量在生態休眠和休眠解除時期高于抑制性休眠和內休眠時期，我們可以推測，茉莉酸含量增加是有利于芽的萌發與生長，并促進果梅花芽打破休眠。Rinne等在楊樹上研究表明，除了FT、CENLl等基因外，脂質體相關的1，3-β-葡聚糖水解酶基因家族（GHl7）也參與了休眠調控，光周期、低溫、赤霉素3和赤霉素4均可上調該基因的表達，從而促進FT和CENLl的表達，休眠芽停止休眠，重新恢復生長。盡管GA3和GA4都可以促進基因的表達，但只有GA4在實際中促進休眠芽的萌發。本研究中，推測茉莉酸也可能具有GA4打破休眠的功能。Sasaki等通過基因芯片技術在擬南芥中發現，41個茉莉酸響應的基因中有5個是茉莉酸合成途徑的基因，而JAs的合成途徑是屬于正反饋調控的。茉莉酸合成途徑基因的過量表達會促進茉莉酸的合成，如番茄中AOC基因的過量表達提升了花組織中JAs的含量，茉莉酸合成途徑的產物又為其提供了一條正反饋回路。在果梅休眠期間，施加一定濃度的茉莉酸是否會促進其正反饋路徑，使信號效應可以不斷逐級放大，誘導一系列的后續反應，達到休眠解除的效果，還需要進一步驗證。