云南玉溪煙區(qū)煙草蚜蟲(chóng)對(duì)植物源農(nóng)藥的敏感性及其解毒酶活力比較

達(dá)愛(ài)斯　溫麗娜　謝道燕　戴勛　田育天　夏玉珍　何成興　吳文偉　柴建萍　胡保文　王正旭　楊澤　羅雁婕　林莉

摘要：應(yīng)用噴霧法測(cè)定了采自云南省玉溪市新平縣新化鄉(xiāng)和峨山縣岔河鄉(xiāng)的煙草蚜蟲(chóng)種群對(duì)6種植物源殺蟲(chóng)劑的毒力，并比較了2個(gè)煙蚜種群的3種主要解毒代謝酶活力、乙酰膽堿酯酶活力。結(jié)果表明，峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜對(duì)植物源殺蟲(chóng)劑的敏感性高于新平縣新化鄉(xiāng)的煙蚜，其中0.5%藜蘆堿可溶液劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑、1%苦皮藤素水乳劑、2%除蟲(chóng)菊素水乳劑、除蟲(chóng)菊浸膏對(duì)新平縣新化鄉(xiāng)和峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的毒力比分別為1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037；在高濃度處理下，6種植物源殺蟲(chóng)劑對(duì)峨山縣岔河鄉(xiāng)、新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的室內(nèi)盆栽藥效存在顯著性差異；0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿小劑在濃度不低于1125mL/hm²時(shí)，可有效防治峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑在濃度不低于2250mL/hm²時(shí)，可有效防治新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜；2個(gè)地區(qū)煙蚜的谷胱甘肽s一轉(zhuǎn)移酶比活力有顯著差異，而羧酸酯酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶、乙酰膽堿酯酶的比活力差異不顯著。由結(jié)果可知，云南省玉溪市峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對(duì)6種植物源殺蟲(chóng)劑的敏感性存在顯著差異，但羧酸酯酶、P450單加氧酶和乙酰膽堿酯酶3種解毒酶差異不顯著，研究結(jié)果可為使用植物源殺蟲(chóng)劑防治煙蚜提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：煙蚜；植物源殺蟲(chóng)劑；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶；羧酸酯酶；細(xì)胞色素P450單加氧酶；乙酰膽堿酯酶

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）05-0137-04

煙蚜（Myzus persicae）別稱(chēng)桃蚜，屬同翅目蚜科瘤蚜屬，是一種重要的煙草害蟲(chóng)，也是煙草病毒病的傳播介體。煙蚜以刺吸式口器吸收煙株葉、莖、花等部位的汁液，使被害煙株生長(zhǎng)遲緩、葉片薄，嚴(yán)重時(shí)葉片向背面卷縮、變形，煙葉組織被破壞，而且煙蚜分泌蜜露污染煙葉，烘烤后的煙葉缺乏光澤，容易破碎，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。化學(xué)防治是防治煙蚜的主要措施之一，然而長(zhǎng)期使用化學(xué)防治，致使煙蚜的抗藥性不斷增強(qiáng)及再猖獗發(fā)生，且使煙葉農(nóng)藥殘留增加。因此，低毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性的植物源殺蟲(chóng)劑日益受到了國(guó)內(nèi)外的重視。

植物源殺蟲(chóng)劑是植物與病蟲(chóng)害的長(zhǎng)期斗爭(zhēng)中產(chǎn)生的具有選擇性殺蟲(chóng)、殺菌活性的一系列次生代謝物。植物源殺蟲(chóng)劑具有選擇性，且對(duì)非靶標(biāo)生物安全，能維護(hù)生態(tài)平衡，在自然界中更易降解而使其農(nóng)藥殘留的危害降低，對(duì)自然環(huán)境產(chǎn)生的影響較小。玉溪市是云南省具有悠久歷史的煙葉重要產(chǎn)區(qū)，也是種植規(guī)模最大的地、州、市級(jí)煙區(qū)之一，對(duì)煙草病蟲(chóng)害的防治極為重視。本研究為篩選適于防治煙蚜的植物殺蟲(chóng)劑，并明確峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的抗藥性及其對(duì)不同植物源殺蟲(chóng)劑的敏感性，比較了0.5%藜蘆堿可溶液劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑、除蟲(chóng)菊浸膏6種植物源殺蟲(chóng)劑對(duì)玉溪市新平縣新化鄉(xiāng)和峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的室內(nèi)毒力及其防治效果，并比較了2個(gè)煙區(qū)煙蚜解毒酶的比活力，以期對(duì)上述煙區(qū)使用植物源殺蟲(chóng)劑防治煙蚜提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試蟲(chóng)源新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜種群采自云南省玉溪市新平縣新化鄉(xiāng)大寨常委會(huì)的煙株上，峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜種群采白玉溪市峨山縣岔河鄉(xiāng)文山村委會(huì)的煙株上，這2個(gè)種群分別在室內(nèi)利用盆栽煙苗進(jìn)行飼養(yǎng)及擴(kuò)繁。

1.1.2供試藥劑0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑均由成都新朝陽(yáng)作物科學(xué)有限公司生產(chǎn)；0.3%苦參堿水劑由南通神雨綠色藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；除蟲(chóng)菊素浸膏（乙醇浸出液）由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所提供。

1.1.3試驗(yàn)試劑考馬斯亮藍(lán)（；250、細(xì)胞色素c、還原型谷胱甘肽，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；牛血清白蛋白，云科生物工程公司生產(chǎn)；3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺、5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸），阿達(dá)瑪斯一貝塔公司生產(chǎn)；毒扁豆堿、堅(jiān)固藍(lán)B鹽、1-氯-2，4-二硝基苯，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；乙酸-α-萘酯，海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；碘化硫代乙酰膽堿，CROSORGANICS公司生產(chǎn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1室內(nèi)毒力測(cè)定方法以及盆栽藥效試驗(yàn)室內(nèi)毒力測(cè)定以及盆栽藥效試驗(yàn)均采用噴霧法，在溫室內(nèi)盆栽煙苗，待其生長(zhǎng)到4～5張葉片接人煙蚜，讓其自然擴(kuò)繁到一定數(shù)量后，進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)；每個(gè)藥劑設(shè)置6個(gè)濃度，以清水為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，各個(gè)重復(fù)隨機(jī)排列，用小型噴霧器對(duì)煙蚜蟲(chóng)進(jìn)行葉面噴霧防治，每個(gè)處理的總噴霧量為150mL藥液。每株煙苗隨機(jī)標(biāo)記3張展開(kāi)葉，并調(diào)查煙蚜數(shù)量；施藥24h后調(diào)查煙蚜活蟲(chóng)數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析其室內(nèi)毒力、防效。

1.2.2解毒酶比活力測(cè)定

1.2.2.1粗酶液制備及酶源蛋白質(zhì)含量的測(cè)定選取50頭煙蚜，加0.05mol/L、pH值7.5的Tris-HCl緩沖液1mL，冰浴研漿，離心（4℃，12000r/min）20min，取上清作為工作酶液。蛋白含量測(cè)定采用Bradford的方法，用考馬斯亮藍(lán)染色，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.2.2谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）的測(cè)定

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對(duì)1-氯-2，4-二硝基苯的活性測(cè)定參照相關(guān)文獻(xiàn)并改進(jìn)，每個(gè)處理樣品各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)總體積為300mL，先分別加入100μL0.6mmol/LCDNB、100μL6mmol/L谷胱甘肽，混勻后在37℃條件下放置20min；然后加入100μ待測(cè)酶液（對(duì)照加入0.05mol/L、pH值7.5的Tris-HCl緩沖液）。利用酶標(biāo)儀于37℃條件測(cè)定340nm下5min內(nèi)吸光度D340nm的變化，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2.3羧酸酯酶的測(cè)定

羧酸酯酶的活性測(cè)定參照并改進(jìn)VanA@eren的方法，用α-萘酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。每個(gè)處理樣品各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)總體積為200mL，先分別加入10μL的0.3mmol/L底物、75μL酶液（對(duì)照加入0.04mol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液），混勻后在30℃條件下放置10min；然后加入顯色劑25μL，利用酶標(biāo)儀于30℃條件測(cè)定600nm處的D600nm值，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和酶原蛋白含量的測(cè)定結(jié)果，將D600nm值換算成比活力。

1.2.2.4細(xì)胞色素P450單加氧酶的測(cè)定根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法并進(jìn)一步改進(jìn)，以細(xì)胞色素c制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。每個(gè)處理樣品各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)總體積為325μL，先分別加入200μ的3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺、80μ磷酸鉀緩沖液（0.625mol/L，pH值7.2），然后加入20μL酶液（對(duì)照加入0.04mol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液），最后加入25μLH2O2，混勻后在室溫（25～27℃）放置2h。測(cè)定450nm處的D450bnm值，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和酶原蛋白含量的測(cè)定結(jié)果，將，D450nm值換算成比活力。

1.2.2.5

乙酰膽堿酯酶的測(cè)定參考Ellman等的方法并進(jìn)一步改進(jìn)。以碘代硫代乙酰膽堿（ATChI）為反應(yīng)底物、5，5'-二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）為顯色劑。每個(gè)處理樣品各設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)總體積為300mL，先分別加入100μL10mmol/L的碘代硫代乙酰膽堿、100μL0.1mol/L磷酸緩沖液（pH值7.5）；再加入50μL酶液（對(duì)照加入0.1mol/L、pH值為7.5的PBS），混勻后在37℃條件下放置10min；再加入0.125mmol/L的DTNB，于37℃條件測(cè)定412nm處10min內(nèi)的D412nm變化值，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及方差分析均采用SPSS軟件（sPSS17.0）進(jìn)行，毒力回歸式由機(jī)率值分析法計(jì)算得到，并采用Duncan's新復(fù)極差法和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較各處理間的差異性。

2.結(jié)果與分析

2.16種植物源殺蟲(chóng)劑對(duì)煙蚜的室內(nèi)毒力

采用噴霧法測(cè)定了6種植物源殺蟲(chóng)劑對(duì)2個(gè)煙區(qū)煙蚜的室內(nèi)毒力。結(jié)果表明，峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜對(duì)藥劑敏感性高于新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對(duì)藥劑敏感性，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲(chóng)菊浸膏對(duì)峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的半致死濃度（LC50）分別為2.356、6.632、5.640、2.592、1.642、15.053mg/L；6種藥劑對(duì)新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的半致死濃度LCso分別為4.288、509.615、11.927、2.736、3.115、482.249mh/L；6種藥劑對(duì)新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜與峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的毒力比分別為1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037（表1）。峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對(duì)不同藥劑的敏感性存在差異，其中對(duì)2%除蟲(chóng)菊素水乳劑、除蟲(chóng)菊浸膏的敏感性差異較大，可能是新平縣新化鄉(xiāng)使用菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑防治而使煙蚜產(chǎn)生耐藥性所造成的。

2.26種植物源殺蟲(chóng)劑對(duì)2個(gè)煙區(qū)煙蚜的盆栽藥效試驗(yàn)

比較了6種植物源殺蟲(chóng)劑對(duì)峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜藥后24h的盆栽藥效，防效結(jié)果見(jiàn)表2。由表2中結(jié)果可知，6種植物源殺蟲(chóng)劑除了除蟲(chóng)菊浸膏外，在4500mL²、2250mL/hm²的處理對(duì)峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的防治效果顯著高于對(duì)新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的防效（獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05）。在峨山縣岔河鄉(xiāng)，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲(chóng)菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑可有效防治煙蚜，其在相同濃度處理下的防效不存在顯著性差異（P<0.05，Duncan's新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)）；而對(duì)于新平縣新化鄉(xiāng)的煙蚜，僅有0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑的防效較高，4500mL/hm²濃度下其他部分藥劑的防效存在顯著差異。在2個(gè)煙區(qū)中，O.5%藜蘆堿可溶液劑相對(duì)于其他藥劑具有較好的防效，2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑次之，1.0%苦皮藤素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲(chóng)菊浸膏（乙醇浸出液）依次降低。此外，6種植物源殺蟲(chóng)劑除了除蟲(chóng)菊浸膏外，其在1125mL/hm²處理可有效防治峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，與高濃度處理無(wú)顯著差異；對(duì)于新平縣新化鄉(xiāng)，其藥劑濃度大于2250mL/hm²處理的防治才與其他處理存在顯著性差異。因此，峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜對(duì)藥劑的敏感性明顯高于新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑在不低于1125mL/hm²的條件下可有效防治峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲(chóng)菊素水乳劑在不低于2250mL/hmμ²的條件下可有效防治新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜。

2.3峨山縣岔河鄉(xiāng)、新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜解毒酶活力比較

采用生化法比較了峨山縣岔河鄉(xiāng)、新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶、乙酰膽堿酯酶4種解毒酶的比活力，結(jié)果見(jiàn)表3。可以看出，岔河鄉(xiāng)、新化鄉(xiāng)煙蚜的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的比活力分別為0.7644、2.0724mmol/（μg·min）；羧酸酯酶的比活力分別為4.8230、6.4444mmol/（μg·min）；細(xì)胞色素P450單加氧酶的比活力分別為2.3563、4.0482EU/（μg·min）；乙酰膽堿酯酶的比活力分別為0.0166、0.0136mmol/（min·mg）。峨山縣岔河鄉(xiāng)與新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶、乙酰膽堿酯酶的活力比分別為2.7111、1.3362、1.7180、0.8193。因此，新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜除乙酰膽堿酯酶外其他3種解毒酶比活力均高于峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，但2個(gè)地區(qū)煙蚜除谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶比活力間差異顯著，其他3種解毒酶比活力無(wú)顯著性差異（獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)）。

3.結(jié)論與討論

本研究應(yīng)用噴霧法比較了分別采自云南省玉溪市峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)的煙蚜種群對(duì)6種植物源殺蟲(chóng)劑的毒力和室內(nèi)防治效果，并比較了2個(gè)煙蚜種群的3種解毒酶和1個(gè)靶標(biāo)酶的比活力。結(jié)果表明，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲(chóng)菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲(chóng)菊浸膏對(duì)新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜與峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的毒力比分別1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037，即新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對(duì)6種藥劑的敏感性低于對(duì)峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，其室內(nèi)毒力高于峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜毒力；而在高濃度處理下，室內(nèi)防效顯著低于峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜。新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶的比活力均高于峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，但羧酸酯酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶的比活力不存在顯著性差異，這可能是峨山縣岔河鄉(xiāng)、新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對(duì)藥劑的耐藥性差異不顯著所致。

新平縣新化鄉(xiāng)一直以來(lái)主要采用常規(guī)化學(xué)防治，使得當(dāng)?shù)氐臒熝练N群對(duì)防控藥劑敏感性下降，室內(nèi)防控效果下降，解毒酶比活力增加。而峨山縣岔河鄉(xiāng)的田間煙蚜的施藥時(shí)間較短且次數(shù)較少，對(duì)藥劑比較敏感。6種植物源殺蟲(chóng)劑中，新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對(duì)2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑和擬除蟲(chóng)菊膏的敏感性最低。0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑在不低于1125mL/hm²可有效防治峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，其在相同濃度處理下的防效不存在顯著性差異。0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲(chóng)菊素水乳劑在不低于2250mL/hm²的條件下對(duì)新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的防效較高，與其他藥劑存在顯著性差異。

綜上所述，云南省玉溪市峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對(duì)0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲(chóng)菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲(chóng)菊浸膏6種植物源殺蟲(chóng)劑的敏感性存在不同的差異，除谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的比活力差異顯著外，其他3種解毒酶的比活力均無(wú)顯著差異。0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑在不低于1125mL/hm2的條件下可有效防治峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜；0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲(chóng)菊素水乳劑在不低于2250mL/hm²的條件下可有效防治新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜。本研究結(jié)果可為在煙草上使用植物源殺蟲(chóng)劑防治煙蚜提供科學(xué)依據(jù)。