棘孢木霉對水稻紋枯病病原菌立枯絲核菌生物防治的研究

陳立華　金秋　牛明　張營　邵孝侯　翟亞明

摘要：為了檢測棘孢木霉T12對立枯絲核菌的生防效果，測定了T12對立枯絲核菌RS02菌株競爭性抑制作用，T12揮發性代謝物對RSO2菌核萌發和菌絲生長的影響，T12的發酵液對tlS02菌核萌發、菌絲干質量和侵染相關酶活力的影響。結果顯示，培養4d的T12通過空間競爭對RSO2生長產生抑制，抑制率達78.7%；T12產生的揮發性物質對菌核萌發和菌絲生長抑制率分別為10.3%、12.2%；大于10%濃度T12發酵液對菌核萌發、菌絲干質量均表現出顯著或明顯的抑制效果，50%濃度發酵液對菌核萌發、菌絲干質量的抑制率分別為65.7%、88.2%；培養5d，10%、30%、50%濃度發酵液處理的tlS02纖維素酶活力分別降低了17.4%、55.0%、76.8%，果膠酶活力分別降低了21.8%、53.9、69.5%。綜合試驗結果可知，棘孢木霉T12能夠顯著抑制立枯絲核菌的生長并降低其侵染能力。

關鍵詞：立枯絲核菌；菌核；棘孢木霉；生物防治

中圖分類號：S435.111.4+2 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0115-03

水稻紋枯病是水稻的重要病害，病原菌立枯絲核菌（Rhi-zoctonia solania Kahn）能夠在土壤中存活數年，菌核是其主要的侵染源。水稻秸稈還田為紋枯病的發生提供了大量的病源，同時紋枯病病菌對特效藥井岡霉素抗性逐年增加，因此迫切須要尋找新的控制水稻紋枯病的方法。棘孢木霉Trichodermaasperellum12菌株是筆者所在實驗室分離的對水稻紋枯病具有生防效果的微生物菌株，由于針對棘孢木霉生防水稻紋枯病的報道較少，因此本研究針對棘孢木霉T.asperellum12菌株對立枯絲核菌生長和侵染能力的影響開展相關研究。

1.材料與方法

1.1供試菌株與試驗材料

供試的棘孢木霉Trichodermaasperellum12（T12）菌株從江蘇省鹽城市的灘涂土壤中分離，通過PDA培養基培養，于4℃保存；水稻紋枯病Rhizoctonia solaniaO2（RS02）菌株由河海大學農業環境研究所提供，通過PDA培養基培養，于4℃保存。水稻品種選用武運粳21號，由江蘇中江種業股份有限公司生產。

1.2生防菌株T12菌核和發酵液的制備

將RS02接種到PDA培養基上，于28℃培養14d，用無菌鑷子捏取菌核放置在無菌濾紙上保存備用。取在PDA上培養3d的T12菌落邊緣菌餅3塊，接種到放置200mL液體PDA培養液的500mL三角瓶中，于28qC、120r/rain培養96h。用無菌棉花和O.45um無菌濾器過濾發酵液，將獲得的無菌T12發酵液于4℃保藏備用。

1.3生防菌T12對RS02的競爭抑制作用

取在PDA上培養3d的T12、RS02菌落邊緣的菌餅（直徑0.5cm），同時接種到PDA培養基上對峙培養，菌餅之間的距離2cm；以只接種RS02菌餅的培養皿為對照，于28℃培養。每天拍照，通過Photoshop軟件測定菌落形成的不規則圖形面積，研究T12對RS02生長的影響。

1.4生防菌T12揮發性物質對RSO2菌核萌發和菌絲生長的影響

在PDA培養基中接種T12菌落邊緣的菌餅，分別于28℃培養0、4d。將菌核均勻地接種到水瓊脂培養基上，將培養皿倒扣在培養0、4d的T12培養皿上，以未接種T12的空PDA培養基作為對照，培養皿接口處用Parafilm封口膜封口，于28℃培養36h，測定菌核萌發率。

在PDA培養基中接種T12、RS02菌落邊緣的菌餅，T12分別于28℃培養0、4d，將T12、RS02的2個培養皿倒扣，培養皿接口處用Parafilm封口膜封口，以沒有接種T12的培養皿為對照，于28℃培養5d，測定RS02的菌落直徑。

1.5

生防菌T12發酵液對RSO2菌核萌發的影響

用T12無菌發酵液、熔解的無菌水瓊脂培養基和無菌水混合成培養基，培養基中水瓊脂培養基比例相同，發酵液濃度分別設為0、1%、5%、10%、20%、30%、50%，培養基倒入平皿后均勻地接種RS02菌核，每天測定菌核的萌發率。

1.6生防菌T12發酵液對RSO2菌絲生長的影響

將PDA液體培養基、T12發酵液無菌過濾液和無菌水按照比例混合成培養液，培養液中的PDA比例相同，T12發酵液濃度分別設為0、1%、5%、10%、20%、30%、50%。在250mL三角瓶中放置100mE培養液，接種1塊RS02菌餅，于28℃、50r/rain培養5d。用無菌濾紙過濾培養液中形成的菌絲，測定菌絲質量。

1.7生防菌T12發酵液對RS02侵染相關酶活力的影響

培養液按照“1.5”節的方法制備，T12發酵液濃度分別設為0、10%、30%、50%。在培養液中添加0.5%果膠、0.5%羧甲基纖維作為RS02產纖維素酶、果膠酶的培養基。在250mL三角瓶中裝100mE液體培養基，每個處理的三角瓶中接種1塊RSO2菌餅，于28℃、50r/rain培養6d。用高速離心機離心分離菌絲，測定上清液果膠酶、纖維素酶活力，測定菌絲干質量。

利用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖的生成量。以羧甲基纖維素鈉為底物，測定纖維素酶活力，酶活力單位u定義：1h產生相當于1umol葡萄糖還原物質所需酶量為1個單位酶活。以果膠為底物測定果膠酶活力，酶活力單位u定義：1h釋放出相當于1txmol半乳糖醛酸的還原物質所需要的酶量為1個酶活力單位。

2.結果與分析

2.1生防菌T12對RS02生長的抑制作用

RSO2單獨培養以及與T12對峙培養的菌落面積如圖1所示。對照處理RS02的菌絲5d即長滿平皿，與T12對峙培養的RS02菌落在培養4d基本停止生長；相較于對照處理的菌絲形成面積，對峙培養處理菌絲生長面積減少了78.7%；培養5d時，T12菌株菌絲開始覆蓋RSO2菌絲。

2.2生防菌T12揮發性物質對RSO2菌核萌發和菌絲生長的影響

T12揮發性代謝物對RSO2菌核萌發、菌絲生長的影響見表1。T12、RSO2同時接種時，T12代謝的揮發性物質對RSO2的菌核萌發率、菌絲生長速度影響不顯著；生長4d的T12菌株代謝物顯著抑制菌核孢子萌發、菌絲的生長，抑制率分別為10.3%、12.2%.

2.3生防菌T12發酵液對RSO2菌核萌發、菌絲干質量的影響

由圖2可知，5%的T12發酵液對RSO2的菌核萌發幾乎沒有抑制效果，高于10%濃度的T12發酵液能夠顯著抑制菌核的萌發，50%濃度的發酵液對菌核萌發抑制率達65.7%。

不同處理對RS02菌絲干質量的影響見圖3，可見5%發酵液處理菌絲干質量與對照處理沒有明顯差異，其他處理菌絲干質量均明顯低于對照處理（P<0.05）；隨著發酵液濃度的增加，菌絲干質量越低；RS02培養5d時，相較于對照處理，50%發酵液處理的菌絲干質量降低了88.2%。

2.4生防菌T12發酵液對RSO2侵染性酶活力的影響

RSO2培養過程中單位菌絲質量對應的酶活力如圖4所示，可見各處理培養5d都能夠檢測到酶活力。結果顯示，10%、30%、50%濃度的T12發酵液均能夠抑制RS02產酶，單位菌絲質量酶活力明顯降低。培養5d時，相較于對照處理，10%、30%、50%濃度發酵液處理的纖維素酶活力分別降低了17.4%、55.O%、76.8%，果膠酶活力分別降低了21.8%、53.9%、69.5%。

3.討論

試驗顯示，棘孢木霉能夠通過生長競爭減小立枯絲核菌的生存空間，這是實現對立枯絲核菌有效防控的途徑之一。木霉屬真菌能夠代謝數十種具有抗生作用的化學物質，其中部分化學物質是具有揮發_性的小分子，棘孢木霉對培養皿上立枯絲核菌菌核萌發和菌絲生長的抑制作用證明，T12菌株也能夠代謝具有抑制立枯絲核菌作用的代謝物。與立枯絲核菌同時接種的棘孢木霉沒有表現出對菌核萌發和菌絲生長的抑制，表明T12菌株的代謝物主要是成熟期產生。木霉菌的發酵液含有木霉產生的各種代謝物，試驗顯示10%以上濃度發酵液均顯著地抑制立枯絲核菌菌核的萌發和菌絲的生長，這與木霉屬真菌生防效果的報道一致。木霉能夠通過競爭、產生拮抗物質等手段抑制病原菌，但是關于木霉代謝物對立枯絲核菌侵染能力的影響報道較少。本研究結果顯示，棘孢木霉T12的代謝物能夠顯著降低立枯絲核菌單位質量菌絲產生的纖維素酶和果膠酶活力，表明棘孢木霉代謝物能夠顯著降低立枯絲核菌的侵染能力。棘孢木霉抑制立枯絲核菌的繁殖和侵染能力的研究，對于進一步開發防效更佳的生防產品具有十分重要的理論意義。