櫻桃流膠病拮抗內生細菌的篩選與初步鑒定

郭建偉等

摘要：為了篩選櫻桃流膠病病原菌葡萄座腔菌拮抗內生細菌，將櫻桃主干樹皮、一年生枝條、樹葉等櫻桃組織經表面消毒后各取5 g置于無菌研缽中研磨，梯度稀釋后涂布LB培養基，挑取并純化內生細菌，然后接種在PDA培養基上與葡萄座腔菌對峙培養，依據生理生化特征初步鑒定獲得的拮抗內生細菌。結果表明，從櫻桃的主干樹皮、一年生枝條、葉片分別分離到內生細菌10、5、6株，拮抗菌株4、2、2株，表現出明顯的組織分布差異性；其中C2-1、C2-2、C2-3、C3-6等4株拮抗內生細菌的抑制率在50.0%～66.7%，具有良好的開發應用前景。8株拮抗內生細菌經生理生化特征鑒定均隸屬于芽孢桿菌屬。

關鍵詞：櫻桃流膠病；內生細菌；拮抗；篩選；鑒定；芽孢桿菌

中圖分類號： S436.629文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0172-03

櫻桃流膠病（cherry gummosis）是普遍發生的櫻桃病害之一，主要危害枝干，引起主干、枝條等流膠，輕者樹勢衰弱、果實產量及質量降低，重者主枝甚至整株枯死[1]。流膠病又分為生理性流膠病和侵染性流膠病[1-4]，后者病原為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothoidea）[3]和丁香假單胞菌（Pesudomonas syringae）[4]。據吳小芹等報道，葡萄座腔菌能引起5個屬針葉樹和40個屬闊葉樹的潰瘍、流膠、枝枯、果實腐爛，分布幾乎遍及全球[5]。該菌引起的櫻桃流膠病在山東、四川等地果園發病率在70%以上[1，6]，云南省的富民縣、馬關縣、魯甸縣、石屏縣、彝良縣、紫溪鎮等地均有千畝以上的規模化種植，具有潛在的暴發風險。目前，櫻桃流膠病的化學防治主要采用銅制劑，但殺菌劑的頻繁使用會導致致病菌產生抗藥性。生物防治以其不污染環境、無生態毒性、對人畜安全等優點成為植物保護研究的熱點之一[7-8]。據高玲玲等報道，棉花、小麥、玉米、油菜、辣椒、馬鈴薯、芭蕉、葡萄等經濟作物內存在豐富的內生拮抗細菌[9]。內生細菌系統地分布于植物組織內，既能受到植物組織的保護，還可以從植物組織持續不斷地吸收充足的碳源和氮源，比暴露于強烈的日光、紫外線、暴風雨、干旱等惡劣環境的附生細菌具有更穩定的生存環境，還具有固氮、促生、抗旱等生物學功能，具有良好的開發利用前景[9-10]。目前利用櫻桃流膠病拮抗內生細菌的研究鮮見報道，本試驗旨在探索櫻桃內生細菌的分離方法并篩選拮抗菌株，為櫻桃的優質高產提供潛在的生防菌株。

1材料與方法

1.1供試材料

櫻桃流膠病病原菌葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）BOD02、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAA01，由紅河學院云南省高校作物高效優質栽培重點實驗室提供；培養基：馬鈴薯培養基（PDA）、LB培養基。

1.2內生細菌的分離

1.2.1樣品采集從云南省蒙自縣紅河學院校園分別采集櫻桃主干樹皮、一年生枝條、樹葉，置于無菌自封袋內帶回實驗室分離內生細菌。

1.2.2內生細菌的分離和純化將樹皮、枝條、葉組織修剪整齊，分別放入75%乙醇中消毒5 min，再轉入含有效氯10%的NaClO中消毒5 min（樹皮、枝條）或2 min（葉），無菌水浸洗2～3次，最后用無菌濾紙吸干表面水分；同時，以最后1遍浸洗消毒組織的無菌水涂布上述平板作為對照檢驗消毒效果。分別取5 g樣品置無菌研缽中，加15 mL無菌水研磨，靜置50 s，再吸取上清液依次稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4，取30 μL分別涂布LB，置于30 ℃恒溫箱培養2～3 d；待長出菌落后，根據細菌形態、顏色、質地、大小對不同的菌落反復劃線純化[11]。

1.3內生細菌對櫻桃流膠病病原菌的拮抗測定

1.3.1葡萄座腔菌和內生細菌的培養將葡萄座腔菌接種在PDA平板上，25 ℃恒溫培養，待菌絲長滿平板后轉4 ℃冰箱保存備用；將純化的內生細菌接種于LB液體培養基，28 ℃、160 r/min振蕩培養24 h，離心12 min（6 000 r/min，4 ℃），取沉淀以無菌水懸浮并調整濃度為106 CFU/mL。

1.3.2拮抗測定用打孔器在菌落邊緣取直徑為5 mm 的病原菌菌餅，將菌絲面朝下接種于PDA平板的中央，28 ℃培養2 d后，在距病原菌30 mm 處對稱擺放相同孔徑的滅菌單層濾紙片，再吸取5 μL供試細菌懸浮液滴加在濾紙片上，每平板4株，3個重復，以浸潤無菌水的濾紙片為對照，繼續培養3～7 d，檢查是否有抑菌圈形成，并測量對照病原菌菌落的擴展半徑（R0）與對峙培養病原菌的擴展半徑（Ri），以下列公式計算相對抑制率（I）。

I=（R0-Ri）/R0×100%。

1.4拮抗菌株的鑒定

對拮抗性菌株及解淀粉芽孢桿菌BAA01（主要作為革蘭氏染色、芽孢染色的陽性對照）進行革蘭氏染色、芽孢染色、硝酸鹽還原反應、V-P試驗、檸檬酸鹽利用、淀粉水解、接觸酶試驗、H2S反應、酪蛋白水解、氧化酶反應，以及葡萄糖、D-果糖、乳糖、D-甘露醇、D-木糖產酸、NaCl耐受性、生長溫度范圍測試等形態學及生理生化特征分析，初步鑒定內生細菌[12]。

2結果與分析

2.1櫻桃內生細菌的分離

利用涂布平板法，根據菌落的形態、顏色、質地、大小等形態學宏觀特征劃線純化，分別從櫻桃的樹皮、枝條、葉分離內生細菌10、5、6株，共計21株。結果表明，櫻桃不同組織內生細菌的種群密度由大到小依次為樹皮（主干）>葉>枝（一年生），這種差異可能與櫻桃組織的年齡相關。

2.2內生細菌對葡萄座腔菌的拮抗測定

采用對峙培養法利用PDA培養基篩選出對櫻桃流膠病葡萄座腔菌具有一定拮抗作用的內生細菌8株，占測試內生細菌的38.10%。其中，4株分離自櫻桃主干樹皮，2株分離自櫻桃一年生枝條，2株分離自櫻桃葉片；分離自主干樹皮的菌株C2-1、C2-2、C2-3及分離自樹葉的C3-6有較強的抑菌作用（表1）。

2.3拮抗內生細菌的鑒定

以解淀粉芽孢桿菌BAA01作為參照菌株，對8株拮抗內生細菌進行形態學和生理生化鑒定，結果（表1）表明：C1-1、C2-1、C2-2、C2-3、C2-5、C3-5、C3-6等7株拮抗內生細菌，革蘭氏染色、芽孢染色、硝酸鹽還原反應、V-P試驗、檸檬酸鹽利用、淀粉水解、接觸酶試驗、H2S反應、酪蛋白水解、氧化酶反應，以及葡萄糖、D-果糖、乳糖、D-甘露醇、D-木糖產酸等均呈陽性，能耐受3%～7%的NaCl，不耐10 ℃的低溫與50 ℃的高溫；C1-3革蘭氏染色、芽孢染色、硝酸鹽還原反應、V-P試驗、淀粉水解、接觸酶試驗、H2S反應、酪蛋白水解、氧化酶反應，以及葡萄糖、D-果糖、乳糖、D-甘露醇、D-木糖產酸等均呈陽性，檸檬酸鹽利用呈陰性，能耐受3%～7%的NaCl，不耐10 ℃的低溫與50 ℃的高溫。根據上述鑒定結果，參考《常見細菌系統鑒定手冊》[12]，可以初步確定上述菌株屬于芽孢桿菌屬。

3結論與討論

研究表明，內生細菌廣泛分布于植物體根、莖、葉等器官、組織的細胞或細胞間隙[9，11，13-15]。本研究結果表明，櫻桃內生細菌及拮抗內生細菌的種群密度，主干樹皮明顯高于一年生枝條和葉片，這與植物內生菌具有組織分布差異性、組織年齡的物種多樣性及種群密度較高的研究結果[16-17]是一致的。

據田甜等報道，從42份土樣中分離到山核桃干腐病葡萄座腔菌的拮抗真菌3株、拮抗放線菌2株[18]；劉雪紅等從1份鹽堿土中分離到1株冬棗輪紋病葡萄座腔菌拮抗性芽孢桿菌[19]。上述研究均是從不含病原菌葡萄座腔菌的異地土壤篩選拮抗菌株，而本研究從櫻桃的主干樹皮、一年生枝條、葉片篩選到8株流膠病葡萄座腔菌拮抗菌株，表明接近病原菌的材料或許含有更豐富的拮抗性微生物。本研究中4株拮抗菌株的相對抑菌率在50%及以上（尤其是內生細菌C2-3達66.7%），表現出良好的潛在應用價值；8株拮抗菌株經生理生化鑒定為芽孢桿菌屬。芽孢桿菌以抗逆性強等優點已有商品化菌劑應用于農業病蟲害防治[9]，但生防菌的田間防效會因物理、化學、微生物種群等因素的影響而降低[20]，因而室內篩選的生防菌尚需盆栽試驗進一步驗證。表18株拮抗內生細菌對櫻桃流膠病的相對抑菌率及生理生化特征

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