地楓皮組織培養獲得再生植株的研究

李小泉等

摘要：采用組織培養快繁技術培養地楓皮種苗，為人工栽培提供優良地楓皮種苗。以地楓皮的莖段、頂芽作為外植體，用不同的培養基進行誘導培養獲得叢生芽，進而生根獲得再生植株。結果表明，地楓皮初代誘導較好的培養基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；培養基MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA較有利于叢生芽繼代增殖，增殖系數為3.2；培養基1/2MS+1.0 mg/L IAA較適宜誘導地楓皮無菌芽的生根；在適宜的基質上移栽，地楓皮種苗成活率為70%。得出的方法具有不受季節和地點限制、繁殖系數較高等優點，隨著研究不斷深入，技術不斷完善，將為地楓皮種苗繁育提供技術支持。

關鍵詞：地楓皮；組織培養；叢生芽；生根

中圖分類號：Q943.1 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0087-03

收稿日期：2015-03-09

基金項目：廣西科學研究與技術開發計劃（編號：桂科合14125008-2-21）；廣西醫療衛生重點科研課題（編號：重2012115、重200908）；廣西壯族自治區衛生廳中醫藥科技專項（編號：GZBZ14-14）；廣西自然科學基金重點項目（編號：2011GXNSFD018037）。

作者簡介：李小泉（1968—），男，廣西全州人，碩士，副研究員，從事植物組織培養研究。E-mail：1941243276@qq.com。

通信作者：李林軒，助理研究員，從事中藥資源保護與開發利用研究。E-mail：starry1125@sina.com。地楓（Illicium difengpi K.I.B.et K.I.M.）別稱鉆地風、追地風、山八角，地楓皮為其干燥樹皮，為木蘭科八角屬珍稀瀕危藥用植物[1]。地楓皮主要分布于廣西靖西、天峨、都安、馬山、龍州等縣的巖溶石山山頂，為廣西的特有中藥材[2-3]，其莖皮、根皮具有祛風除濕、行氣止痛等功效，常用于治療風濕痹痛、氣滯腹痛、婦人經期腹痛等癥狀，治療效果好，藥用價值高，為多種中成藥的主要原材料[4]。地楓皮生境分布范圍狹窄，生長緩慢，且藥用部位為莖皮與根皮，因此采收后植株也無法成活。目前地楓皮藥用資源來源于野生自然資源，由于地楓皮種子皮較薄，干燥時種子的油脂會變質，過濕時又容易腐爛，極易喪失發芽能力，加上其生長所需的石灰巖土壤稀少，無法為地楓皮種子的萌芽提供適宜的環境，造成地楓皮繁殖能力弱。隨著地楓皮藥用需求量不斷增加，野生自然資源不斷減少，在很多地區瀕臨滅絕或已絕跡，1999年地楓皮被批準為國家Ⅱ級重點保護野生植物[1]。目前對地楓皮的研究主要集中在資源調查[3]、真偽鑒別[5]、分子標記[6]、化學成分[7]、藥理作用[8]等方面，在種苗培育方面還未見報道。因此，本研究通過對地楓皮進行組織培養研究，以期為地楓皮人工栽培提供大量優良種苗，對于保護地楓皮野生種質資源和維護生態系統多樣性具有重要意義。

1材料與方法

1.1供試材料

采集廣西藥用植物園大棚內盆栽的地楓皮，剪取健壯無病蟲害植株的莖段、頂芽為外植體。

1.2試驗方法

1.2.1外植體滅菌及培養條件將地楓皮莖段、頂芽用洗潔精水浸泡10 min，用清水沖洗15 min，濾干水后在超凈工作臺中用75%乙醇浸泡30 s，用無菌水清洗1次；在0.1%HgCl2溶液中浸泡5～12 min，用無菌水沖洗3次，每次浸洗3 min，用無菌濾紙吸干外植體表面水分后，接種于誘導培養基中。培養條件為培養溫度（25±3） ℃、光照時間12 h/d、光照度1 500～2 000 lx。培養基中含2%蔗糖、5%瓊脂，pH值5.8～62。

1.2.2初代誘導培養基篩選初代誘導以MS為基本培養基，添加不同濃度的植物生長調節劑，誘導培養基分別為：0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A1處理）、1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A2處理）、1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A3處理）、2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A4處理）。最佳基本培養基的篩選：將誘導得到的無菌芽分別接入上述試驗中獲得的最佳生長調節劑組合的MS、B5、N68、VW、N6、ER基本培養基中，觀察其生長狀況。

1.2.3繼代增殖培養以初代誘導培養試驗為基礎，考察植物生長調節劑對地楓皮叢生芽的影響，設計激素種類和濃度組合為：1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA（B1處理）、2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA（B2處理）、1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA（B3處理）、2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA（B4處理）。

1.2.4生根培養生根培養基：1/2MS+1.0 mg/L NAA（C1處理）、1/2MS+1.0 mg/L IBA（C2處理）、1/2MS+1.0 mg/LIAA（C3處理）。

1.3計算公式

相關計算公式如下：

污染率=污染外植體數/接種數×100%；（1）

死亡數=死亡外植體數/總外植體數×100%；（2）

誘導率=出芽外植體數/總外植體數×100%；（3）

增殖系數=增殖芽數/接種數；（4）

誘導率=出芽數/接種數×100%。 （5）

2結果與分析

2.1滅菌時間篩選

分別設5、8、10、12 min 4個滅菌時間進行試驗，外植體接入初代誘導培養基中培養10～15 d，記錄污染的外植體數，統計污染率。30 d時分別記錄死亡的外植體數，統計死亡率、成功率。由統計結果可以看出，在不同滅菌時間里，地楓皮的莖段、頂芽的污染率、死亡率均有差異，其中頂芽滅菌8 min時效果最好，污染率僅為20%，死亡率為0；而莖段的滅菌時間以10 min效果最好，污染率為30%，無死亡（表1、表2）。

2.2初代誘導培養基篩選

外植體培養10～15 d時，頂芽、腋芽開始萌動，長出小芽（萌芽情況見圖1、圖2）。A3培養基中的萌芽率最高，頂芽誘導為100%，莖段誘導率達到90%；因此，初代誘導最佳培養基為1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（表3）。

將初代培養中誘導出來的芽接入附加1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的MS、B5、N68、VW、N6、ER培養基中培養。由于不同基本培養基中元素的種類和濃度均有所不同，培養 30 d 時，在不同培養基中芽的長勢、芽數均有很大區別，其中MS培養基中的芽壯且數目較多，而在VW培養基中的芽細且數量少。不同培養基中芽的長勢從壯到弱順序為：MS>ER>B5>N6>N68>VW。

2.3植物生長調節劑對地楓皮繼代增殖的影響

將初代誘導得到的健壯單芽接入附加6-BA、KT、ZT、NAA濃度組合的MS培養基上培養，12 d后形成叢生芽，30 d后統計各培養基中的芽數、增殖系數，觀察芽的長勢。從表4可以看出，培養基B2對地楓皮增殖作用比較好，增殖系數為3.2。因此，地楓皮繼代增殖最佳培養基為2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LKT+0.3 mg/L NAA。

2.4生長素對地楓皮組培苗生根的影響

地楓皮增殖芽長至2～3 cm高時，切分成單芽，接入C1、C2、C3處理3種生根培養基中培養，在C1處理培養基中無菌芽基部膨大，形成大量愈傷組織；在C2、C3處理培養基中均長根，但根的粗細和數量有所不同。其中在C2處理培養基中無菌芽的根數較少，為5～10條，根較細；在C3處理培養基中的無菌芽根數較多，為10～20條，粗細適中（圖3）。因此，地楓皮無菌芽生根較好的培養基為：1/2MS+1.0 mg/L IAA（表5）。

2.5煉苗移栽

地楓皮組培苗長至3～4 cm高時，根據地楓皮的生長特性在溫室內將已生根的試管苗煉苗3 d，洗凈試管苗根部的培養基，移栽到滅過菌的沙子中，成活率為70%。

3結論與討論

自1937年White建立第1個植物組織培養基以來，許多研究者報道了各種培養基，其數量多，配方各異。基本培養基

表5植物生長調節劑對地楓皮生根培養的影響

培養基編號接種數

（個）生根數

（條）生根率

（%）生長情況C11000基部膨大，大量愈傷組織C21010100根細，根系少C31010100根粗細適中，根系多

的篩選對植物組織培養有著重要的影響。隨著組織培養技術飛速發展，根據植物種類和部位的不同要求，研制出的基本培養基多達685種[9]。由于同一科屬植物生長習性相近，其所用的基本培養基也相似。地楓皮原生境為巖溶石山山頂，生長的土壤為黑色石灰土，土壤含有較高的交換性鈣和有機質[10]，本試驗研究表明，地楓皮組織培養最適的基本培養基為MS，MS具有較高的無機鹽濃度，能夠保證組織生長所需的礦質營養，非常適合地楓皮生長，與其同科屬八角組織培養的基本培養基相同[11]。

在植物組培快速繁殖技術研究中，為了提高增殖系數，縮短培育時間，便于大規模生產種苗，在其基本培養基中附加不同種類、濃度的激素，以滿足不同培養階段需求。在繼代增殖階段，許多研究已經表明細胞分裂素可以促進叢生芽的增殖[12-13]，本試驗以6-BA、ZT、KT與NAA聯合配比使用，發現MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA誘導效果較好，芽長勢好、葉色翠綠。在生根階段，生長素類物質對植物生根具有促進作用，本試驗以NAA、IBA、IAA 3種生長素與6-BA配比使用，研究不同生長素對地楓皮無菌苗生根誘導的影響。結果表明IAA對地楓皮無菌芽生根誘導優于IBA，NAA可以誘導地楓皮無菌芽產生愈傷組織，但對生根誘導作用甚微。 NAA是一種廣譜的植物生長調節劑，具有促進細胞分裂、誘導不定根形成的作用[14]，但是在培養過程中也經常出現致使材料老化、形成愈傷組織[15]的現象；而IBA、IAA則是植物自身能夠形成的內源生長素，能促進細胞分裂與生長，誘導形成不定根[16-21]。

綜上所述，在地楓皮組培快繁技術研究中，地楓皮的莖段、頂芽均可作為組織培養的外植體，MS為較適合的基本培養基，初代誘導較好的培養基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；最佳繼代增殖培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA，增殖系數為3.2；最佳生根培養基為：1/2MS+1.0 mg/L IAA。本研究為地楓皮種苗繁育打下良好的基礎，也為地楓皮良種選育提供技術平臺。

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