應用正交測驗法優選巨菌草誘導培養基

黃靜等

摘要：以巨菌草幼莖作為試驗材料，研究不同濃度的防褐化物質對巨菌草組織培養褐化的影響，應用正交測驗法研究生長激素2，4-D、KT、IAA不同的濃度對巨菌草愈傷組織誘導的影響。結果表明：最佳防褐化物質是1.0 mg/L PVP；2，4-D對巨菌草幼莖愈傷組織誘導的影響最小，KT居于二者之間，沒有達到顯著水平，而IAA影響最大，達到了顯著水平（P<0.05）；巨菌草誘導愈傷組織的最佳培養基配方是MS+2，4-D 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L。

關鍵詞：巨菌草；防褐化；正交測驗法；愈傷組織；培養基；激素

中圖分類號： S646.904文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0074-03

收稿日期：2014-09-06

基金項目：國家菌草工程技術研究中心開放基金（編號：JCJJ13003）。

作者簡介：黃靜（1988—），女，山東泗水人，碩士研究生，研究方向為草業育種學。Tel：（0591）83789338；E-mail：hj880866@126.com。

通信作者：鄭燕，博士，副教授，從事草業育種學研究。Tel：（0591）83789338；E-mail：swallow1318@126.com。巨菌草（Pennisetum sp.）屬于單子葉植物禾本科狼尾草屬，是一種適宜在熱帶、亞熱帶和溫帶生長的高產優質菌草。其抗逆性強，根系發達，為直立叢生的多年生植物，植株高大，一般為3～5 m，有的也可達到6～8 m[1-2]。巨菌草是典型的C4植物，光合效率很高，是其他闊葉樹的4～7.46倍，年產鮮草達200～400 t/hm2[3]。巨菌草原產于南非，1983年引入我國，并由于其巨大的經濟價值得到了廣泛推廣。

巨菌草是一種高產優質的菌草，抗逆性極強，一般不會有病蟲害發生，管理簡單，利用期長，生長速度快，粗蛋白含量很高，營養價值豐富[3]，可作為生產飼料和保持水土、綠化環境的優良草種[4]，也被用作香菇、靈芝、平菇、猴頭菇等的栽培培養料[5]。此外，巨菌草還是能源草的典型草種，可用于生產乙醇等生物燃料。巨菌草種植簡單，既可以進行有性繁殖，也可以進行無性繁殖。無性繁殖一般用腋芽進行，有性繁殖用種子，但是發芽率一般都很低[4]。目前，巨菌草在我國南方的種植范圍越來越廣，由于不耐寒，在北方寒冷的冬季無法自然越冬，使得在北方的推廣受到嚴重限制[6]。

長期以來，巨菌草品種選育方面基本是依靠常規育種的方法，因而無法快速解決巨菌草耐寒性、品質及產量改良等問題。植物基因工程技術是解決品種改良的一種高效手段，而完整的巨菌草組織培養體系是對其進行基因工程遺傳改良的前提和技術保障。目前國內尚未見巨菌草組織培養體系構建的報道。本研究擬參考其他禾本科植物如甘蔗、雜交狼尾草、絨毛狼尾草等的組織培養方法，優選巨菌草誘導培養基，為巨菌草品種改良提供試驗依據，也為其更大范圍的應用和推廣提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為巨菌草幼莖，由福建農林大學國家菌草工程技術研究中心提供。

1.2方法

1.2.1外植體的準備及消毒選取幼嫩并且生長良好的巨菌草莖稈，用75%乙醇逐層擦拭較老的葉鞘表面并剝除直至所需要材料的前2層，用刀切下莖尖部分，然后置于2%次氯酸鈉中消毒10 min，用無菌水沖洗3～ 5次，在無菌濾紙上吸干水分[7]。

1.2.2防止褐化為了防止外植體的褐變，采用組織培養中常用的活性炭（activated carbon，AC）和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）2種防褐化物質，在相同培養基下添加不同濃度的2種物質，觀察對巨菌草出愈率的影響[8]。所用培養基組合如表1所示。

表12種防褐化物質濃度設計

處理編號防褐化物質 濃度（ mg/L）Ⅰ1AC0.1Ⅰ2AC0.2Ⅰ3AC0.3Ⅰ4PVP0.5Ⅰ5PVP1.0Ⅰ6PVP1.5注：基本培養基均為MS+2，4-D 3.0 mg/L。

用手術刀把莖尖分生組織部分切成0.1～ 0.2 cm厚的小薄片，接種于表1中培養基上，每瓶接種6塊外植體，3次重復。然后置于26～28 ℃的暗培養箱中培養[9-10]，10 d后比較出愈情況，運用Excel 和統計分析軟件DPS進行統計分析。

1.2.3正交測驗法篩選最佳誘導培養基配方采用L9（33）正交設計，使用的正交表如表2所示[8]，設置3個影響因子，分別為2，4-D、KT和IAA。基本培養基為MS，3種激素 2，4-D、KT 和IAA各設3個濃度水平，2，4-D濃度為1.0、2.0、3.0 mg/L；KT濃度為0.5、1.0、1.5 mg/L；IAA濃度為 0.1、 0.2、0.3 mg/L[7，9，11-12]。共9個處理，每個處理接種3瓶，每瓶5塊外植體，3次生物學重復（時間重復），統計愈傷率，運用Excel 和DPS進行方差分析和差異顯著性測驗，確定最佳激素組合。

2結果與分析

2.1不同防褐化物質對愈傷組織誘導的影響

從表3可看出，在相同培養基MS+2，4-D 3.0 mg/L下，采用不同濃度的防褐化物質AC與PVP對巨菌草幼莖愈傷組織誘導的效率明顯不同。用AC作為防褐化物質時，不同濃度下出愈率雖然有變化，但差異不顯著；用PVP作為防2種不同防褐化物質AC與PVP相比，采用PVP比AC產生的出愈率明顯更高（表3）。從圖1可以看出，巨菌草幼莖在接種10 d后，培養基加入PVP的外植體已經長出一點愈傷組織，而培養基加入AC的外植體還沒有長出愈傷組織。特別是采用濃度為1.0 mg/L的PVP產生的出愈率最高，故本研究都采用此濃度。