河南省育成花生品種的幼葉體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)

苗利娟等

摘要：選用河南省育成的5個(gè)不同類型的花生品種，在6種培養(yǎng)基配方及2種光照處理下進(jìn)行胚小葉外植體誘導(dǎo)體胚效率研究。結(jié)果表明，豫花1號(hào)、豫花22號(hào)、豫花9719、豫花9847等4個(gè)品種體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率均在2，4-D濃度為15 mg/L時(shí)最高，2種光周期處理的趨勢一致，豫花9719的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率最高。在4周全黑暗培養(yǎng)條件下，豫花12號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率在2，4-D濃度為5 mg/L時(shí)最高，而在暗2周轉(zhuǎn)光暗交替（其中光照培養(yǎng)16 h，黑暗培養(yǎng)8 h）2周處理?xiàng)l件下，2，4-D濃度為10 mg/L時(shí)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率最高，達(dá)45.00%；可見暗培養(yǎng)的平均誘導(dǎo)率低于暗2周轉(zhuǎn)光暗交替2周處理。因此，以育成品種胚小葉為外植體直接誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，2，4-D濃度以10～15 mg/L為宜，暗2周轉(zhuǎn)光暗交替2周處理的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率較高。

關(guān)鍵詞：花生；幼葉；體細(xì)胞胚胎；培養(yǎng)基；光周期

中圖分類號(hào)： S565.203.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0068-03

收稿日期：2014-05-06

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2011CB109304）；國家“863”計(jì)劃（編號(hào)：2013AA102602）；國家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-14）；河南省財(cái)政專項(xiàng)（編號(hào)：201218305）。

作者簡介：苗利娟（1981—），女，河南滑縣人，碩士，助理研究員，主要從事花生基因工程研究工作。Tel：（0371）65750825；E-mail：miao8139@163.com。

通信作者：張新友，博士，研究員，主要從事花生遺傳育種研究工作。Tel：（0371）65729560；E-mail：haasz@126.com。花生是我國重要的油料作物，在全國各省（區(qū)、市）均有種植。近年來，河南省花生種植面積位居全國首位，常年種植面積穩(wěn)定在100萬hm2左右。在氣候惡化、災(zāi)害性天氣頻發(fā)、環(huán)境污染等問題下，為生產(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的花生優(yōu)良品種、對(duì)保障花生生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展和食用油安全具有重要意義。眾所周知，栽培花生遺傳基礎(chǔ)狹窄，缺乏抗病、抗蟲、耐逆性突出的種質(zhì)資源，常規(guī)育種難以在優(yōu)質(zhì)、多抗新品種選育方面取得重大突破；野生種質(zhì)的優(yōu)異基因常與一些不良性狀基因連鎖，且與栽培種之間存在雜交不親和、雜種不育等障礙，難以直接通過雜交方法加以利用。基因工程為花生利用外源基因提供有效途徑，已有多例利用基因工程進(jìn)行花生代謝途徑遺傳調(diào)控或?qū)⑼庠椿虺晒D(zhuǎn)入花生，改良花生品質(zhì)、抗病、抗蟲、耐旱、耐鹽等性狀的研究報(bào)道[1-9]。然而，基因轉(zhuǎn)化及植株再生效率受基因型影響較大，國內(nèi)外遺傳轉(zhuǎn)化的成功實(shí)例基本局限在少數(shù)幾個(gè)誘導(dǎo)率較高的基因型上。本研究旨在探索河南省育成花生品種的組培再生效果，擴(kuò)大花生基因轉(zhuǎn)化的受體基因型范圍，為基因工程技術(shù)與常規(guī)育種的結(jié)合奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1植物基因型

選用不同時(shí)期河南省育成審定的5個(gè)花生品種：豫花1號(hào)、豫花12號(hào)、豫花22號(hào)、豫花9719、豫花9847，其中豫花1號(hào)、豫花9719為大果品種，豫花12號(hào)、豫花22號(hào)為小果品種，豫花9847為中果品種。

1.2胚小葉外植體制備及培養(yǎng)

選取籽粒飽滿、無破損的花生種子，置于三角瓶中，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇浸潤洗30 s，然后用0.1% HgCl2浸泡8～10 min，中間輕搖數(shù)次，用無菌水沖洗3～4次，浸泡3～4 h，用鑷子將種皮去掉，并掰去1張子葉，將帶胚軸子葉接種于MS培養(yǎng)基中，于25 ℃ 下光照培養(yǎng)。取出培養(yǎng)4 d的帶胚軸子葉，在超凈工作臺(tái)上從小葉柄以上切取胚小葉，接種于體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基（以MS為基本培養(yǎng)基，附加1、3、5、10、15、20 mg/L 2，4-D，分別記為培養(yǎng)基1、2、3、4、5、6），每個(gè)品種接種50個(gè)外植體，重復(fù)2次，置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，設(shè)2個(gè)光照處理：全黑暗培養(yǎng)4周、暗2周轉(zhuǎn)光暗交替（其中光照培養(yǎng)16 h、黑暗培養(yǎng)8 h）2周。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

4周后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)胚外植體數(shù)，計(jì)算體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率：體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率=產(chǎn)胚外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1體細(xì)胞胚的形成

預(yù)培養(yǎng)4 d的胚小葉外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，1周后葉片切口處膨大并有少量的黃綠色愈傷組織出現(xiàn)；培養(yǎng)至3周左右，愈傷組織表面出現(xiàn)顆粒狀突起，隨著繼代時(shí)間的延長，很快形成簇狀、易剝離的體細(xì)胞胚，每個(gè)外植體上形成3～5 個(gè)體細(xì)胞胚，顏色為淡綠色（圖1）。

2.2不同基因型品種體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率

豫花1號(hào)、豫花22號(hào)、豫花9719、豫花9847等4個(gè)品種的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率均在2，4-D濃度為15 mg/L時(shí)最高，2種光周期處理的趨勢一致：當(dāng)2，4-D濃度為0～15 mg/L時(shí)，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率基本上隨2，4-D濃度的升高而逐漸提高，其中豫花9719的體胚誘導(dǎo)率最高，最高達(dá)75.58%；其次為豫花1號(hào)；當(dāng)2，4-D濃度為20 mg/L時(shí)，這4個(gè)品種體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率明顯降低（圖2-A至圖2-D）。在全黑暗培養(yǎng)4周的條件下，只有豫花12號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率在2，4-D濃度為5 mg/L時(shí)最高；在暗2周轉(zhuǎn)光暗交替2周條件下，豫花12號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率在2，4-D濃度10 mg/L時(shí)最高，達(dá)4500%（圖2-E），高于全黑暗培養(yǎng)4周處理的誘導(dǎo)率，不同基因型花生體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率差異很大，大多數(shù)品種的誘導(dǎo)率在 2，4-D 濃度為10～15 mg/L 時(shí)較高，可見2，4-D的適宜濃度為10～15 mg/L。

2.3光周期對(duì)體細(xì)胞胚再生率的影響

由表1可知，全暗培養(yǎng)4周處理的平均誘導(dǎo)率低于暗2周轉(zhuǎn)光暗交替處理。其中，豫花1號(hào)和豫花9847等2個(gè)品種體胚誘導(dǎo)率在這2種光周期培養(yǎng)條件下的差異較大，而豫花9719的體胚誘導(dǎo)率在這2種光周期培養(yǎng)條件下差異較小。可見，在暗2周轉(zhuǎn)光暗交替2周條件下誘導(dǎo)胚狀體可以提高

3結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，以胚小葉為外植體直接誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，培養(yǎng)基中2，4-D濃度以10～15 mg/L為宜，光周期以暗2周轉(zhuǎn)光暗交替2周處理的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率較高。不同基因型花生體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率差異很大，豫花9719的體胚誘導(dǎo)率最高，達(dá)到75.58%。

3.12，4-D最佳濃度差異

2，4-D是體細(xì)胞胚誘導(dǎo)常用的激素，喬利仙等研究了山東省不同類型花生品種的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和再生情況，在2，4-D濃度為10 mg/L下獲得較高的體胚誘導(dǎo)率[10]。蔣菁等以花生胚小葉為外植體，在含10 mg/L 2，4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，體胚誘導(dǎo)率最高的達(dá)到62.8%[11-12]。周蓉等發(fā)現(xiàn) 10 mg/L 2，4-D有利于提高體胚誘導(dǎo)率[13]。劉艷芝等以花生品種四粒紅的胚軸為外植體，誘導(dǎo)體胚2，4-D最佳濃度為20 mg/L，體細(xì)胞胚發(fā)生率達(dá)到66.67%。有的研究結(jié)果與本研究的10～15 mg/L為最佳濃度范圍有所不同，這可能由選用不同的基因型和不同外植體對(duì)誘導(dǎo)的反應(yīng)差異所致。

3.2基因型誘導(dǎo)反應(yīng)差異

Chengalrayan等比較了美國弗吉尼亞型（普通型大花生）與蘭娜型（小花生）的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和再生反應(yīng)，結(jié)果表明，胚性愈傷誘導(dǎo)率、體細(xì)胞胚發(fā)生和再生率與基因型相關(guān)，結(jié)果顯示蘭娜型比弗吉尼亞型誘導(dǎo)效應(yīng)強(qiáng)[15]。喬利仙等認(rèn)為，在2，4-D濃度為10 mg/L時(shí)，珍珠豆型和普通型品種體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率變異范圍較相近，為42.2%～85.0%，龍生型體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率61.1%～87.8%，魯花14號(hào)、魯花8號(hào)、魯花9號(hào)、魯花22號(hào)等中間型品種體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率為84.1%～912%[10]。本研究的普通型大花生豫花9719具有較高的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率，珍珠豆型花生品種豫花22號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率較低，進(jìn)一步說明不同基因型對(duì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)反應(yīng)差異較大。

3.3光周期處理差異

前人利用不同外植體直接誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生，在光周期方面也進(jìn)行了大量研究，結(jié)果表明黑暗培養(yǎng)的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率稍低[11，16-17]，與本研究結(jié)果一致。但進(jìn)一步的體細(xì)胞胚萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果顯示，黑暗培養(yǎng)的體細(xì)胞胚易于再生植株；本研究中黑暗處理對(duì)體細(xì)胞胚再生的影響有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

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