利用染色體片段代換系定位水稻HL型育性恢復基因

張宏根等

摘要：以水稻9311為背景、日本晴為供體構建的一套染色體片段代換系為試驗材料，利用HL型秈稻不育系粵泰A與代換系測交，根據測交F1群體的花粉育性和小穗育性，結合Bin-map，采用多元回歸的方法，對HL型粵泰A的育性恢復QTL進行分析。以花粉育性為指標檢測到3個QTLs，分別位于第2、6和10染色體上，定位區段大小為 379 262、1 853 725、1 229 303 bp；以自然小穗育性為指標檢測到3個QTLs，分別位于第1、第3和第11染色體上，定位區段大小為455 070、525 340、247 226 bp。

關鍵詞：水稻；染色體片段代換系；恢復基因；基因定位

中圖分類號： S511.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0064-04

收稿日期：2014-09-06

基金項目：國家“973”計劃（編號：2011CB100101）；國家自然科學基金（編號：31071384）；江蘇省高校自然科學研究項目（編號：13KJ13210008）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目。

作者簡介：張宏根（1981—），男，江蘇南通人，博士，講師，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：zhg@yzu.edu.cn。

通信作者：湯述翥，教授，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：sztang@yzu.edu.cn。〖FL（2K2]目前，我國主要有9種胞質不育系類型用于生產，以野敗（WA）型、紅蓮（HL）型和包臺（BT）型為3種代表類型[1]。WA型不育系敗育徹底、不育性穩定，在雜交秈稻生產利用中占據主導地位。近年來，HL型不育系在雜交秈稻中應用越來越廣泛。雜交粳稻以利用BT型不育系為主，推廣面積較小。要發展三系雜交稻，HL型雜交秈稻在生產上進一步的利用是一條重要途徑。HL型不育系的恢復譜較廣，但強恢復系很少，恢復系選育是限制HL型雜交秈稻進一步發展的重要因素。

質核互作雄性不育系的育性恢復是一復雜的遺傳性狀，并且環境對目標性狀表型的影響較大。已有的研究表明，HL型不育系花粉表現為圓敗，其育性恢復由主效基因與微效基因共同控制，且基因間可能存在互作[2-4]。目前，在秈稻核背景下，HL型不育系的主效育性恢復基因已被定位[5-9]，而微效基因的定位及基因效應研究相對較少[10]。因此，有效地開展HL型不育系微效基因的定位是選育HL型強恢復系的關鍵。

如何對微效恢復基因進行定位是育性恢復遺傳研究的難點。染色體片段代換系與受體親本的遺傳背景基本一致，其與受體親本之間以及系與系之間只有單個或少數的染色體片段的差異，因此其表現出的任何差異都可以直接與導入的片段或被替換的片段聯系起來，是進行QTL分析及精細定位目標QTL的理想材料。目前，在水稻中已經有很多的學者利用染色體片段代換系來定位重要性狀的QTL[11-16]。為定位HL型秈稻不育系的微效恢復基因，本試驗在已有研究基礎上以水稻9311為背景、日本晴為供體構建的一套染色體片段代換系為試驗材料（利用高通量測序對每一個系基因組進行了重新測序，每個系中的代換片段長度及位置均準確獲知），其中9311為HL型強恢復系，日本晴為HL型不育系的保持系，利用HL型秈稻不育系粵泰A與代換系測交，根據測交F1群體的花粉育性和小穗育性，結合Bin-map，采用多元回歸的方法，對HL型不育系育性恢復的QTL進行分析，相關研究結果有助于HL型恢復系的選育。

1材料與方法

1.1供試材料

以粳稻測序品種日本晴為供體，秈稻測序品種9311為受體構建的128個染色體片段代換系（C1-C128），9311及HL型秈稻不育系粵泰A。

1.2群體配置

2010年正季在揚州種植親本9311、HL型粵泰A及128個CSSLs，并配制F1：HL型粵泰A/128CSSLs。成熟時實際收到119個測交F1組合的種子。

2011年春季在海南種植親本9311、HL型粵泰A、128個CSSLs以及2010年正季獲得的各F1，并繼續配制HL型粵泰A/128CSSLs。成熟時收獲各F1種子。

2011年正季在揚州種植各親本以及海南收獲的各測交F1，每份材料各種植10苗。由于2011年海南春季溫度偏低，配制的一些雜交組合未能收到雜交種，以及播種后一些雜交種沒有成苗或后期因病枯死而缺苗，最終在配制測交群體中實際得到的測交系數目為116個。

1.3抽穗期調查

抽穗后及時記載抽穗期（50%的稻穗抽穗），并折算成播種至抽穗的天數表示。

1.4花粉育性鑒定與小穗育性鑒定

每天07：00—09：00，在田間每個測交系中選取4株單株，從每個始花植株上選取1個已抽出約1/3的主穗或較大分蘗穗。鏡檢時，在每個穗子的中上部枝梗中，選取3朵當天要開放的穎花，用1%I2-KI液染色、壓片，在低倍顯微鏡下觀察花粉育性。根據花粉粒的形狀和對I2-KI液的染色反應，將花粉劃分為典敗、圓敗、染敗和正常4種類型。觀察時，選擇分布均勻、花粉數目超過100粒的視野，分別記錄4類花粉的數目，計算4類花粉的百分率。

在抽穗期間，每天07：00—09：00，選取尚未開花的小穗套袋，自交袋大小為50 cm×20 cm，每系2個袋子，每個袋子2個小穗。20 d后，剔除折斷或自交袋破損的穗子，調查群體單株的自交小穗育性。

待種子成熟后，每測交系選取4個主莖穗考察自然小穗育性。

1.5水稻DNA提取與分子標記分析

水稻基因組DNA的提取采用CTAB法[17]。普通PCR采用20 μL的反應體系：模板DNA 1.0 μL，10×PCR緩沖液2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，03 μmol/L引物2.0 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O補足20 μL。富含GC含量模板的20 μL反應體系包括：DNA，2×GCI緩沖液10 μL，2.5 μmol/L的dNTP 3.2 μL，0.3 μmol/L的引物20 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O補足20 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s（溫度因引物不同而異），72 ℃延伸50 s（不同長度的預期產物按 1 kb/min 調整延伸時間），擴增32個循環；72 ℃延伸10 min，18 ℃保溫。PCR反應產物首先在3%瓊脂糖凝膠中電泳，經溴化乙錠染色后在UVP Bioimaging Systems凝膠成像儀上成像。