一種利用噬菌體裂解大腸桿菌Rosetta菌株菌體的方法

雷琎等

摘要：Escherichia coli Rosetta菌株是基因克隆表達的重要宿主菌，為了探索裂解E.coli Rosetta菌體的新方法，從污水中分離到1株能裂解E.coli Rosetta菌株的噬菌體，命名為ETP-1，并研究其生物學特性和裂解效率。結果表明，EPT-1在雙層平板上形成直徑為1～3 mm的噬菌斑；噬菌斑透明，周圍有暈環；該噬菌體的潛伏期為20min，裂解期為70 min，在55 ℃以上以及pH值大于11時，噬菌體失去活性。在6 h內，噬菌體可裂解73%的E.coli Rosetta菌體，ETP-1裂解其宿主細胞為E.coli Rosetta菌株菌體的破碎提供了新的方法。

關鍵詞：細胞破碎方法；E.coli Rosetta；噬菌體；裂解效率

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0061-03

收稿日期：2014-09-16

基金項目：國家自然科學基金（編號：31160035、31260034）。

作者簡介：雷琎（1989—），男，云南昆明人，碩士研究生，主要從事噬菌體及其蛋白研究。E-mail：leijin1989@hotmail.com。

通信作者：林連兵，碩士，教授，主要從事高溫噬菌體研究。E-mail：570782220@qq.com大腸桿菌系統由于其遺傳學、生物化學和分子生物學方面已充分被人們了解而成為表達多種異源蛋白質的首選系統[1]。迄今為止，由大腸桿菌改造而來的基因工程菌已達近百種之多，常用的就有50種左右[2]，如E.coli BL21、E.coli Rosetta、E.coli JM109、E.coli JM110等。常見的大腸桿菌噬菌體也有很多種，如烈性噬菌體中的T4噬菌體、T1噬菌體，溫和噬菌體中的λ噬菌體[3]。T4噬菌體常用于噬菌體展示，λ噬菌體常作為克隆表達的載體。實驗室中常用E.coli Rosetta作為克隆表達菌株，E.coli Rosetta在E.coli BL21基礎上，補充了大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子對應的tRNA，以提高外源基因尤其是真核基因在原核系統中的表達水平。克隆表達的一般步驟是誘導表達后，直接使用超聲破碎細胞。超聲破碎是一種相對溫和的細胞破碎方法，但是超聲破碎時會產生一定的熱量，對于一些結構不穩定的目的蛋白，其結構依然會被破壞。本研究以E.coli Rosetta為宿主菌，分離E.coli Rosetta的噬菌體，對其進行感染、裂解，對其生物學特征、裂解效果等進行研究，探索使用噬菌體替代超聲破碎細胞的可行性。

1材料與方法

1.1菌種及噬菌體來源

E.coli Rosetta菌株。

1.2主要試劑和儀器

LB培養基、蛋白質電泳系統、恒溫搖床、恒溫培養箱。

1.3ETP-1的分離

采集生活污水10 mL經5 000 g、15 min離心去除雜質，再經0.22 μm的濾膜濾除細菌，收取濾液，吸取濾液5 mL與過夜培養的E.coli Rosetta 培養液5 mL混勻，于37 ℃、12 h振蕩培養。

根據文獻[4]的方法，采用雙層平板法檢測和篩選噬菌體。將上述培養液離心并通過0.22 μm濾膜過濾，取200 μL濾液和200 μL 處于對數期的E.coli Rosetta 菌液混合，靜置15 min后，將其加入裝有4 mL 0.9%瓊脂的預熱LB半固體培養基的離心管中，混勻后平鋪至LB固體培養基上，37 ℃過夜培養，觀察噬菌體的生長情況。若有噬菌斑，挑取單個形態均一噬菌斑。將噬菌斑置于4 mL無菌水的離心管中，37 ℃溫浴0.5 h，取100 μL上述噬菌體懸液和宿主做雙層平板。重復4～5次可得到純噬菌體。

1.4ETP-1的電鏡觀察

取出單個噬菌斑于LB液體培養基中37 ℃過夜培養，用10%的PEG8000在4 ℃下過夜沉淀后，將沉淀溶于SM緩沖液中，再加入CsCl，使其ρ=1.5 g/mL。以36 000 r/min超速離心18 h，抽取噬菌體條帶，通過負染后觀察。

1.5噬菌體一步生長曲線繪制

按照文獻[5]的方法。取一定量的新鮮噬菌體培養液 1 mL （病毒滴度≈107 PFU/mL）與處于對數生長期的E.coli Rosetta 10 mL混合，使得感染復數MOI=0.01，37 ℃溫育 10 min。13 000 g離心2 min，棄上清，用30 μL的LB液體培養基洗滌3次，最后用30 μL LB液體培養基懸浮宿主細胞。取60 μL上述細胞到5 mL LB液體培養基，37 ℃ 180 r/min振蕩培養100 min，同時開始計時，每隔10 min取100 μL培養液測定噬菌體的滴度。以感染時間為橫坐標、滴度的對數為縱坐標，繪制一步生長曲線，估算出噬菌體的潛伏期、暴發期。

1.6溫度對噬菌體活性的影響

按照文獻[5]的方法，將噬菌體懸液（將LB液體培養基099 mL和0.01 mL滴度為1×107 PFU/mL的噬菌體懸液混合），分別置于15、25、35、45、55、60 ℃處理1 h，每隔20 min取樣，用雙層平板測定滴度。試驗重復3次，取平均值。

1.7pH值對噬菌體活性的影響

按照文獻[5]的方法，將pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11的LB液體培養基0.99 mL和0.01 mL滴度為1×107 PFU/mL的噬菌體懸液混合，室溫靜置1 h，分別用雙層平板測定噬菌體滴度。試驗重復3次，取平均值。

1.8ETP-1感染E.coli Rosetta對其生長的影響

分別設立試驗組和對照組，測定Rosetta的生長曲線，當培養至對數期時（D600 nm≈0.6）加入一定效價的噬菌體懸液體，使MOI=0.01，培養20 h，每隔30 min分別測定D600 nm的數值。以橫坐標為時間、縱坐標為D值繪制一條試驗組與對照組的Rosetta生長曲線。

1.9ETP-1對E.coli Rosetta裂解效果

準備3組150 mL的液體培養基在恒溫搖床中振蕩培養E.coli Rosetta，至對數期（D600 nm≈0.6）。分別設立試驗組、對照組和空白組，向試驗組中加入一定效價的噬菌體，使MOI=0.01，空白組加入等量無菌水，然后分別繼續培養6 h。對照組以5 000 g離心，然后將菌體溶于5 mL的LB培養基，使用超聲破碎法破碎細胞。試驗組和空白組先以5 000 g離心，然后取上清，再濃縮至5 mL。分別測定3組的蛋白含量，同時進行SDS-PAGE。

2結果與分析

2.1E.coli Rosetta噬菌體的噬菌斑形態和電鏡圖

通過雙層平板法，分離E.coli Rosetta噬菌體，命名為 ETP-1。EPT-1在雙層平板上形成直徑為1～3 mm的噬菌斑，噬菌斑透明（圖1）。

從電鏡圖（圖2）中可看出，ETP-1有1個正多面體對稱的頭部，直徑約為50 nm，尾長約100 nm，尾部帶有基盤。根據其形態特征，ETP-1屬于有尾噬菌體目長尾噬菌體科。

2.2E.coli Rosetta的噬菌體一步生長曲線

如E.coli Rosetta噬菌體的一步生長曲線（圖3）所示，E.coli Rosetta噬菌體從吸附吸附、侵染、復制到病毒顆粒全部釋放總共持續約110 min。在這個過程中，E.coli Rosetta噬菌體的潛伏期約是20 min，暴發期約70 min。

2.3溫度對噬菌體活性的影響

溫度對噬菌體活性的影響分析結果（圖4）表明，ETP-1在25 ℃最穩定，隨著溫度的升高，ETP-1的存活率降低，在45 ℃和55 ℃經過1 h處理后，噬菌體的滴度降低了50%和80%，在60 ℃處理1 h后，噬菌體基本完全喪失感染能力。

2.4pH值對噬菌體活性的影響

pH值對噬菌體活性影響分析結果（圖5）表明，在pH值4～8內，ETP-1依然保持著90%以上的滴度；當pH值>8后，噬菌體的滴度隨著pH值的增大明顯降低；當pH值=11時，ETP-1僅剩下20%的滴度；噬菌體對于酸性環境有較好的耐受能力，當pH值=3時，ETP-1仍保持著60%以上的滴度。

2.5ETP-1感染對E.coli Rosetta生長的影響

通過上述試驗可知，在3.5 h加入噬菌體ETP-1后（如圖6箭頭所示），試驗組中的E.coli Rosetta的生長受到抑制，其吸光度下降，對照組中的E.coli Rosetta的生長正常。

2.6ETP-1裂解E.coli Rosetta的效果評價

2.6.1蛋白質含量測定通過測定3管液體的蛋白質含量可知，對照組（超聲破碎）蛋白質含量為2.30 mg/mL，試驗組（噬菌體破碎）蛋白質含量為1.69 mg/mL，空白組蛋白質含量為0.16 mg/mL。如果通過超聲破碎的細胞破碎率為100%，以蛋白質含量來衡量破碎率，則通過噬菌體破碎的效率達73%（表1）。

表1細胞裂解液的蛋白質含量

破碎方法蛋白質含量

（mg/mL）破碎率

（%）對照組（超聲破碎）2.30100試驗組（噬菌體破碎）1.6973

2.6.2蛋白質電泳結果通過蛋白質電泳（圖7）可知，泳道1為對照組（超聲破碎），其細胞完全破碎。泳道2為試驗組（噬菌體破碎），泳道1和泳道2的條帶基本一致，表明細胞基本裂解，而部分條帶的丟失可能是細胞中部分細胞器沒有完全裂解造成的。泳道3為空白組，E.coli Rosetta自然情況下也會有少數細胞自行裂解或向外分泌了少量蛋白質。

3討論

噬菌體廣泛存在于細菌存在的環境中，人們對噬菌體的研究取得了可喜的進展。目前對于噬菌體研究一般集中于噬菌體治療、環境噬菌體上。如Cappaeelu等篩選出可以對抗耐藥性金黃色葡萄球菌，并通過此噬菌體來控制金黃色葡萄球菌的感染，取得了良好的臨床效果[6]。又如洪偉等從云南騰沖熱泉中分離出棲熱菌的噬菌體TSP-10，并對其性質進行了研究[7]。

對于分子克隆上，噬菌體研究常見于噬菌體展示技術，如Ellis等指出利用噬菌體展示多肽庫可以篩選和確定線蟲疫苗的抗原，這是疫苗抗原鑒定的一種新方法[8]。而王曉娜等通過噬菌體展示技術從抗體庫中篩選出分枝桿菌Acr蛋白，并制備出了Acr蛋白的抗體[9]。但關于基因工程菌株的噬菌體報道比較少見，僅見黎庶等報道分離出1株基因工程菌株E.coli BL21的噬菌體EECP，并對其性質和防止流入發酵過程做了相關研究[10]。

烈性噬菌體可以高效裂解細菌，其感染效率很高，一般只需要重復4次感染周期，1個噬菌體便可殺死數十億個細菌細胞。鑒于噬菌體有如此強的裂解效率，因此噬菌體可以作為潛在的替代超聲破碎基因工程菌的工具。噬菌體在裂解細菌細胞時，裂解溫和，不會因為物理作用導致基因工程菌表達產物的物理損壞。

在溫度耐受方面，ETP-1在高于55 ℃基本失去感染活性；在pH值耐受方面，ETP-1在pH值超過11后，基本失去活性，而在pH值=3時，仍然有活性，說明ETP-1更能耐受酸性環境。黎庶分離出的BL21噬菌體對高溫耐受能力好，90 ℃時仍具有活性，在pH耐受能力上，表現為耐堿不耐酸，pH值為3時其噬菌體活性基本喪失[10]，這與本試驗室分離的噬菌體在酸堿耐受力上正好相反。

關于噬菌體對細胞裂解效率的文獻報道較少，本研究通過收集裂解后的總蛋白液的蛋白量來定義噬菌體破碎效率，可知ETP-1是一種較高裂解效率的噬菌體，在6 h內噬菌體的裂解效率達到了73%；進一步試驗結果表明，其裂解率在12 h可達到95%以上。鑒于噬菌體ETP-1的培養和裂解不需要專門的設備，如果需要去除裂解液中的噬菌體，可以將裂解液通過簡單的超濾加以過濾收集，噬菌體的滅活可以通過50 ℃的加熱來實現，可見利用ETP-1裂解E.coli Rosetta菌體不失為一種簡單可行菌體破裂的方法。

參考文獻：

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