21個日本牡丹品種DNA指紋圖譜構建與EST—SSR標記遺傳多樣性分析

孫嘉磊等

摘要：采用EST-SSR標記構建中國常熟尚湖牡丹園引栽的21個日本牡丹品種DNA指紋圖譜并進行遺傳多樣性分析。以篩選出的10對多態性高、穩定性好且在染色體上分布均勻的引物作為核心引物，構建日本牡丹21個品種DNA指紋圖譜，用NTSYS-PCV2.10軟件分析遺傳多樣性。結果表明，10對EST-SSR引物在21份材料中共擴增出47個多態性基因型，平均每對引物擴增4.7個，變幅1～11個；10對引物的多態性頻率（FP）平均值為0.522，變幅0227～0.950；篩選出的2對核心引物可以將21個牡丹品種完全區分，以遺傳相似系數0.55為閾值可將21個供試牡丹品種分成2類。由結果可知，EST-SSR標記在供試牡丹品種間多態性差異較大，適合用于牡丹的DNA指紋圖譜的構建。

關鍵詞：EST-SSR；DNA指紋圖譜；遺傳多樣性；牡丹品種

中圖分類號： S685.11文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0050-04

收稿日期：2014-09-21

基金項目：江蘇農業科技支撐計劃（編號：BE2011445）；江蘇省大學生實踐創新訓練計劃（編號：201310333032Y）；江蘇省蘇州市科技計劃（編號：SZS201102、SYN201110、SNG201323）；蘇州市吳江區科技計劃（編號：WN201311、WN201317）；江蘇省常熟市科技計劃（編號：CS201205）。

作者簡介：孫嘉磊（1992—），男，江蘇太倉人，研究方向為植物資源利用開發。

通信作者：楊志剛，碩士，副教授，從事天然產物研究與開發。Tel：（0512）52251562；E-mail：zhigangyang77@sina.cn。牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews.）花大色艷，花香襲人，有“國色天香”之美譽，深受人們喜愛。關于DNA指紋技術在牡丹品種鑒別上的應用，前人做了很多研究。朱紅霞利用AFLP標記對牡丹品種的分類進行了初步探索[1]。Hosoki等利用RAPD標記技術對牡丹品種和野生牡丹品種的DNA序列進行了嘗試性分析[2]。由于技術比較成熟，以微衛星序列為基礎的SSR標記成為當前植物品種DNA指紋圖譜數據庫的首選標記[3]。李保印利用SSR標記技術研究中原牡丹品種初級核心種質和遺傳多樣性，并建立了核心種質[4]。王淼等研究討論了牡丹品種的SSR-PCR反應條件[5]。SSR分子標記技術可以用來區分牡丹品種，這是不容爭辯的事實[6]，近年來EST（expressed sequence tages）發展十分迅速，而EST-SSR與其他鑒別途徑相比，是一種相對準確、簡便、經濟的途徑[7]。Temnykh 等研究顯示，他們所發現的牡丹EST-SSR位點絕大多數都具有多態性潛能[8]。張艷麗等以6個滇牡丹不同花色類群DNA為模板，對EST-SSR引物進行了篩選[9]。

牡丹品種的起源地在中國，在中國牡丹園藝栽培不斷發展的同時，日本也早就開始進行牡丹園藝品種的雜交培育和引種工作，形成了具有地方特色的牡丹品種群[10]，而目前針對國內引栽的日本品系牡丹開展DNA指紋圖譜構建及遺傳多樣性的研究還未見報道。本研究采用EST-SSR標記構建中國常熟尚湖牡丹園21份日本品系牡丹品種的DNA指紋圖譜并進行遺傳多樣性分析，以期為牡丹品種DNA指紋鑒定提供技術支持。

1材料與方法

1.1供試材料

21份牡丹品種為中國常熟尚湖牡丹園引栽的日本牡丹品種，詳見表1。

表1供試21份日本牡丹主栽品種概況

編號品種名稱花色編號品種名稱花色1島錦復色12島大臣紫2島輝紅13金晃黃3日暮紅14海黃黃4百花選紅15玉廉白5火鳥紅16連鶴白6花王深銀紅17黑龍錦墨紫7芳紀火紅18新扶桑白8新日月紅19八千代椿銀紅9紅輝獅子大紅20吉野川粉10花競粉21紫晃粉11皇嘉門黑紫

1.2DNA提取

按照CTAB法提取牡丹基因組DNA，操作流程如下：（1）在研缽中加入100 mg牡丹葉片樣品和700 μL CTAB提取液，充分研磨；（2）轉移混合液至1.5 mL離心管中，65 ℃水浴 30 min，每隔5 min振蕩混勻；（3）取出離心管，冷卻到室溫后，于8 000 r/min離心2 min；（4）取出離心管，將上清液轉移至1.5 mL離心管中，加入等體積三氯甲烷混勻，振蕩10 min；（5）12 000 r/min常溫離心10 min；（6）轉移上清液至1.5 mL離心管中，加等體積異丙醇，混勻后靜置10 min，于 12 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用70%～75%乙醇漂洗沉淀2次，在超凈工作臺上吹干；（7）加50 μL ddH2O，將沉淀DNA溶解后于4 ℃冰箱保存備用。

1.3引物信息

以張艷麗等對滇牡丹不同花色類群開發的10對EST-SSR引物[9]作為本研究的候選引物（表2），引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）純化。

20 μL反應液中包括10×PCR buffer、0.1 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2+、50 ng DNA模版和 03 μmol/L EST-SSR引物。反應程序：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物選用60 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，36 W電泳3 h。參考王鳳格等的快速銀染法[11]并稍加修改：50%乙醇、2.5%冰乙酸組成的固定液固定5 min；雙蒸水快速漂洗1次；0.2%AgNO3染色5 min；15% NaOH、0.4%甲醛組成的顯影液顯影；固定液定影。