天山雪蓮SikMT2基因的克隆及表達分析

陳泉等

摘要：從天山雪蓮葉片cDNA文庫中分析得到一個類金屬硫蛋白基因序列，命名為SikMT2。生物信息學分析表明，該基因包含一個完整開放閱讀框（225 bp），編碼75個氨基酸。SikMT2分子量為7.47 ku，理論等電點是4.44，是一個不具有信號肽的親水性蛋白。氨基酸多序列比對發現，SikMT2序列在N端和C端保守性較高，具有MT2的典型特征；21個物種間的系統發育樹可以看出，天山雪蓮與蒲公英進化關系最近。

關鍵詞：天山雪蓮；SikMT2基因；信息學分析；實時定量PCR

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0046-04

收稿日期：2014-09-10

金屬硫蛋白（metallothioneins，MTs）超家族是一類廣泛存在于人體、動物、植物以及微生物體內的一種包含了半胱氨酸豐富區域小分子蛋白[1]。動物體內的MTs于1957 年首次從蓄積鎘的馬腎中被發現[2]，植物MTs最早從1977年從大豆根中被發現[3]。近些年來研究表明，MTs在植物中普遍存在，參與了許多生理過程，如生長發育、胚胎發生、小孢子發生、衰老、果實的發育、成熟和抗逆等[4]。同時對植物MTs的研究在基因的組織、器官特異性、表達特征、基因組結構和染色體定位方面得到快速的發展[5-7]。不僅如此，有報道稱植物MTs不僅在植物解除重金屬離子的毒害[8]、調節金屬離子特定運輸方面有重要作用[9]，還參與了細胞內氧自由基清除[10]和植物抗氧化脅迫[11]。但現階段我們對植物MTs功能的研究還僅處于起步狀態，MTs參與了植物的許多生理代謝過程而且分布十分廣泛，因此對植物MTs的研究將成為一個具有重要意義的方向。

天山雪蓮（Saussurea involucrata Kar. et Kir）為菊科鳳毛菊屬，別稱新疆雪蓮、雪荷花、雪蓮花等[12]。天山雪蓮主要生長在新疆天山海拔2 400～4 100 m的高山草甸、高山冰磧石、懸崖峭壁石縫等處，最高月平均溫度3～5 ℃，最低月平均溫-19～-21 ℃，為典型的耐極端低溫的多年生高山植物[13]。天山上常年伴隨著強烈的紫外線照射、極大的晝夜溫差、低溫等惡劣環境，但是天山雪蓮產生了適應極端環境條件的獨特的生存機制[14]，在如此惡劣的環境下依舊能旺盛生長并且開花[15]。因此，天山雪蓮參與此類非生物脅迫的基因值得深入研究。

迄今為止，研究人員已經從擬南芥、水稻、蘋果、西瓜、檉柳、小金海棠等多種植物[16-20]中分離出許多MTs基因。但有關天山雪蓮MT基因的研究尚未見報道。本研究以天山雪蓮為試驗材料，克隆得到1個MT基因，并對其序列進行分析，旨在為研究天山雪蓮的抗逆性生理特征奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

天山雪蓮試管苗由石河子大學農業生物技術重點實驗室培養；植物總RNA提取試劑盒購自艾德萊生物科技有限公司；M-MLV試劑盒購自TaKaRa公司；凝膠電泳回收試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；克隆載體pGM19-T購自TaKaRa公司；SYBR GreenⅠMaster Mix購自Roche公司。

1.2方法

1.2.1天山雪蓮SikMT2基因的克隆隨機挑取10個已構建的天山雪蓮葉片組織的cDNA文庫的單克隆，使用通用引物進行PCR鑒定，并對鑒定為陽性的菌株進行測序。通過BLAST分析得到的cDNA片段，獲得SikMT2基因序列，利用Primer5.0設計SikMT2基因的PCR引物SikMT2-F、SikMT2-R、GAPDH-qRTF和GAPDH-qRTR（表1）。天山雪蓮總RNA的提取采用植物總RNA提取試劑盒；cDNA第一鏈的合成按照M-MLV試劑盒操作步驟進行，產物作為RT-PCR模板進行PCR，反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環。PCR產物經回收連接至載體pGM19-T，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，篩選陽性克隆送至北京六合華大基因完成測序。

1.2.2天山雪蓮SikMT2基因的序列分析對獲得的SikMT2基順測序結果利用DNAMAN軟件進行分析，確定開放閱讀框及相應的氨基酸序列。運用Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）網站預測蛋白的保守區；用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）進行蛋白理化性質預測分析；運用Motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）網站進行蛋白質基序預測分析；運用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）網站預測蛋白質的跨膜結構；運用SignalP 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）網站進行蛋白質信號肽預測；運用生物信息學軟件Jpred3（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/index.html）對SikMT2蛋白質進行二級結構預測；運用NCBI網站的BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）工具進行氨基酸對比分析；運用DNAMAN軟件對其他物種的同源氨基酸進行多重比對；運用Clustalx1.83和MEGA5.2軟件構建天山雪蓮SikMT2蛋白的系統進化樹。

1.2.3天山雪蓮SikMT2基因的實時定量PCR（real time-PCR）分析將用于低溫脅迫的天山雪蓮試管苗移入4 ℃光照培養箱進行低溫處理；將用于鹽脅迫的天山雪蓮試管苗轉入含有200 mmol/L的MS培養基中進行處理；將用于干旱脅迫的天山雪蓮試管苗放入含有10%聚乙二醇（polyethyleneglyeol，PEG）的MS培養基中進行處理。分別取處理0（CK）、2、4、8、12、24、36 h的天山雪蓮葉片樣品，液氮速凍，-70 ℃保存備用。分別提取對照和不同時間處理的樣品RNA，反轉錄以cDNA為模版，對SikMT2基因在低溫和氧化脅迫下的表達進行分析。按照Roche公司SYBRG GreenⅠMaster Mix試劑盒說明書操作，以天山雪蓮看家基因GAPDHH作為內參基因（表l），利用Applied Biosystems 7500 Real time PCR擴增，反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。結果采用2-ΔΔCT法對數據進行分析，每個樣品進行3次重復，取平均值。