T-SPOT.TB陽性標本抗原ESAT-6和CFP-10相關性的探討

周玉利　周青雪

T-SPOT.TB陽性標本抗原ESAT-6和CFP-10相關性的探討

周玉利周青雪

目的 探討T-spot.TB陽性標本抗原ESAT-6和CFP-10的相關性。方法 統計2011年1月至2014年7月檢測的T-spot.TB陽性的333例結果，分析其中抗原ESAT-6與CFP-10的結果并評價相關性。結果 抗原ESAT-6陽性占98.49%，抗原CFP-10陽性占77.48%，抗原ESAT-6陽性且CFP-10陰性占22.52%，抗原ESAT-6陰性且CFP-10陽性占10.51%，抗原ESAT-6陽性合并CFP-10陽性占66.97%。結論 T-spot陽性標本中，抗原ESAT-6合并CFP-10陽性的比例最高，抗原ESAT-6陽性且CFP-10陰性的比例高于抗原ESAT-6陰性且CFP-10陽性的比例。

結核桿菌T細胞斑點試驗 抗原靶蛋白6 濾過蛋白10

早期發現和準確診斷是降低結核病發病率、減少傳播機會、控制結核病疫情的關鍵環節。但是，傳統的檢測方法存在較多缺陷，不足以滿足臨床需求。結核桿菌T細胞斑點試驗（T-spot.TB）是一項有效的結核輔助診斷手段，其敏感性和特異度均＞95%［1］。在歐洲已經獲得批準作為結核感染和結核潛伏感染篩查的重要檢測手段［2］。其是應用酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）檢測機體內經結核特異性的RDl區編碼A抗原早期分泌性抗原靶蛋白6（ESAT-6）和B抗原培養濾過蛋白10（CFP-10）肽段庫刺激后釋放γ干擾素的特異性T細胞數量。據此判斷是否有結核桿菌感染的可能，本資料針對疑似結核患者T-spot.TB檢測陽性結果，進行抗原ESAT-6和CFP-10陽性情況的分析，探討其相關性。

1　臨床資料

1.1一般資料 2011年1月至2014年7月本院333例疑似結核患者，血清標本檢測T-spot.TB陽性結果中男179例，女154例；年齡7～76歲，平均年齡（42.6±12.3）歲。

1.2儀器與試劑 Baker生物安全柜，RIVCO C02孵育箱。T-spot.TB試劑盒，淋巴細胞分離液、AIMV、RPMll640、ELISPOT計數儀由上海長征復星公司提供。

1.3方法 （1）T-spot.TB檢測：按T-spot.TB試劑盒操作規范進行。采集外周全血，無須空腹，需用肝素/肝素鋰/肝素鈉抗凝，不得使用EDTA抗凝。采血量要求：＜2歲兒童2～3ml，其他患者4～6 ml，免疫力低下/受抑制患者6～8ml；樣本室溫（15～25℃）保存與運輸，不得冷凍/冷藏；樣本采集后4h內送到實驗室，8h內完成檢測；1周內有輸血史或做過PET-CT的患者會影響血液中淋巴細胞的分離，建議2周后再進行檢測；運輸過程中防止顛簸，避免樣本溶血影響結果。（2）操作過程：外周抗凝全血梯度離心分離外周血單個核細胞（PBMCs），結核特異性抗原（ESAT-6/CFP-10）刺激結核特異的效應T淋巴細胞，使其分泌γ-干擾素，效應T淋巴細胞分泌的γ-干擾素與模板預包被的抗γ-干擾素抗體結合并固定在細胞周圍，傳統的ELISA“雙抗夾心法”使抗原抗體結合物顯色，形成斑點，根據斑點數判斷結果，抗原ESAT-6檢測孔為測試孔A，抗原CFP-10檢測孔為測試孔B。（3）用ELISPOT計數儀（AID iSPOT Reader spectrum，ZEISS，德國）進行斑點閱讀與統計：空白對照孔內斑點數＜10且陽性對照孔內斑點數＞20時視為實驗有效。判定標準為當測試孔A或B達到以下標準則判定為陽性結果：空白對照斑點數為0～5個時且（抗原A或抗原B孔斑點數）-（空白對照孔斑點數）≥6，判斷為陽性（+）；空白對照斑點數為6～10個時且（抗原A或抗原B孔斑點數）≥2×（空白對照孔斑點數），判斷為陽性（+）；若上述標準不符合且陽性質控對照孔正常時檢測結果為陰性（-）。若陰性對照孔斑點數≥10或陽性對照孔斑點數＜20時，結果不能確定。

1.4統計學方法 采用SPSS 11.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1333例T-SPOT.TB陽性患者抗原ESAT-6與抗原CFP-10統計結果 見表1。

表1　333例T-SPOT.TB陽性患者抗原ESAT-6與抗原CFP-10統計結果［n（%）］

2.2333例T-SPOT.TB陽性患者各科室分布情況 在本院內分泌科、感染科、消化科、呼吸科、兒科的T-spot. TB陽性患者中，抗原ESAT-6陽性CFP-10陽性組，抗原ESAT-6陽性且CFP-10陰性組，抗原ESAT-6陰性且CFP-10陽性組，分別所占各科室總數的比例相近，與全院所占的比例66.97%、22.52%、10.51%相符。

3　討論

T-spot.TB技術是利用結核桿菌感染者外周血單個核細胞中存在結核特異性T細胞，這些淋巴細胞在受到結核桿菌特異抗原刺激后分泌IFN-γ 而設計的T細胞免疫斑點試驗。根據斑點數可以推測體內是否存在對結核桿菌反應的效應T細胞，從而實現對結核桿菌感染進行輔助診斷。T-spot.TB檢測采用的MTB特異性抗原為ESAT-6和CFP-10（遺傳基因RD1區丟失），其蛋白編碼來源于結核分枝桿菌基因中的一個菌種特異性基因片斷，被稱為RD1，這個基因片段在大部分的分枝桿菌以及所有的環境分枝桿菌（包括卡介苗）中不存在，因此ESAT-6和CFP-10作為抗原有較高的特異性［3］。但M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登） 四種分枝桿菌亦存在此兩種抗原，T-spot.TB陽性結果有可能是上述分枝桿菌感染引起的。

ESAT-6和CFP-10蛋白是牛分枝桿菌的免疫優勢抗原，可誘導宿主特異性CD4+T細胞、CD8+、CTL增殖及IFN-7大量產生，在保護性細胞免疫反應中發揮重要作用，且能介導長期持久的免疫記憶。但是現今T-spot.TB技術處于發展階段還存在較多不足，該試劑盒在診斷活動性結核病方面的作用尚待確定，目前只能用于檢測是否有結核感染，并不能鑒別活動性結核病和結核潛伏感染［4，5］。

總之，測孔 A和檢測孔B由于所使用的抗原不同，所引起的細胞免疫反應不完全一致，ESAT-6抗原的靈敏度高于CFP-10抗原。且ESAT-6對潛伏感染檢測較為有效，但單獨使用檢出率較低。兩者具有互補性，兩者聯合檢測顯著提高檢測的靈敏度。ESAT-6抗原和CFP-10檢測相關性意義值得更深入研究。

1 Meier T， Eulenbruch HP， Wrighton-Smith P， et al. Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay （T SPOT-TB） for diagnosis of tuberculosis in clinical.practice. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2005，24（8）：529～536.

2 Alfred A Lardizabal.Interferon-Gamma release assay for detection of tuberculosis infection.US Respiratory Disease，2006，54（6）： 59～61.

3 Kim SH ，Song KH，Choi SJ，et al.Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. Am J Med，2009，122（2）：189.

4 Sztajnbok F R，Boecha N L，Sztajnbek D C，et al.The challenge of pediatric tuberculosis in face of new diagnostic techniques .J Pediatr（Rio J），2009， 85（3）： 189～193.

5 Ariga H，Harada N.Evolution of IGRA researches . Kekkaku，2008，83（9）：641～652.

310006 杭州市第一人民醫院檢驗科