蒲公英對胃癌BGC823細胞遷移、侵襲作用的影響

郭欽鈺，陳逸軒，楊 劍，陳文莉，陳新年

（蘭州大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000）

蒲公英對胃癌BGC823細胞遷移、侵襲作用的影響

郭欽鈺，陳逸軒，楊 劍，陳文莉，陳新年

（蘭州大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000）

目的 研究蒲公英對胃癌BGC823細胞遷移、侵襲作用的影響及其機制。方法 不同濃度蒲公英處理細胞后，用MTS、Transwell小室、熒光實時定量PCR等方法分別檢測胃癌BGC823細胞的增值、遷移、侵襲作用以及基質金屬蛋白酶2 （MMP2）基因的表達。結果 2.5 mg/ml蒲公英組抑瘤率為11.27%；對照組遷移細胞數為362個，2.5 mg/ml蒲公英組遷移細胞數為234個（P＜0.05）；對照組侵襲細胞數為266個，2.5 mg/ml蒲公英組侵襲細胞數為183個（P＜0.05）；熒光實時定量PCR結果顯示，2.5 mg/ml蒲公英組胃癌BGC823細胞MMP2基因表達下調。結論 蒲公英可抑制胃癌BGC823細胞生長，使胃癌BGC823細胞的遷移、侵襲作用減弱，其機制可能是蒲公英引起MMP2基因表達下降所致。

蒲公英；胃癌BGC823細胞；遷移；侵襲

胃癌是嚴重危脅人類健康的惡性腫瘤，其發病率在惡性腫瘤中占第二位。胃癌傳統的治療手段，如手術治療、放射治療和化學治療都會給患者帶來一系列不良反應及并發癥。近年來的研究發現，中藥無論在早、中期作為手術、化療以及介入治療的輔助手段，還是在晚期因失去手術機會、不能耐受化療或介入治療時作為主要治療手段都顯示出一定的臨床效果。有研究表明，蒲公英可以抑制體外培養的腫瘤細胞生長［1］，蒲公英提取物、蒲公英多糖等均具有一定的防癌、抑癌作用以及抑制腫瘤引起的炎癥反應［2］，但是其抗腫瘤機制尚不明確。本實驗研究蒲公英水煎劑對胃癌BGC823細胞遷移、侵襲作用的影響，為蒲公英在抗腫瘤方面的研究及應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

藥用蒲公英購自甘肅省蘭州市眾友藥業公司，本實驗所選用的藥用蒲公英由蒲公英全草經熱水提取，減壓濃縮后噴霧干燥而成的粉末，獲得粉末是提取前蒲公英總量的15%。實驗中將蒲公英粉末溶解在RIPM-1640細胞培養液中，按重量體積比分別配制含1.0 mg/ml、2.5 mg/ml蒲公英的細胞培養液，配制好后用0.22μm的一次性濾器過濾除菌。

1.2 試劑與材料

胎牛血清、RIPM-1640細胞培養液（美國Hyclone公司），0.25%胰蛋白酶（美國Gibico公司），DMSO試劑（美國Sigma公司），懸掛式8.0 μm24孔板Transwell小室、0.22 μm一次性針頭濾器、0.45 μm一次性針頭濾器（美國Millipore公司），Matrigel TM Basement Membrane matrix基質膠（美國BD公司），cDNA逆轉錄試劑盒、PrimeScript TM 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TM II試劑盒、瓊脂糖（大連TaKaRa公司），RNA提取試劑Trizol（美國Invitrogen公司），FuGENE 6 Transfection Reagent、CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（北京Promega公司）。

1.3 細胞培養

胃癌BGC823細胞由蘭州大學病理生理研究所提供。將BGC823細胞置入含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RIPM-1640細胞培養液中，置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養，每日觀察細胞情況，及時更換培養液。

1.4 用MTS法檢測蒲公英對胃癌BGC823細胞增殖的影響

胰蛋白酶消化胃癌BGC823細胞，制得1×105/ml的細胞懸液，分別種于96孔板中（1×104/孔），將細胞分為3組，即空白對照組、1.0 mg/ml蒲公英組、2.5 mg/ml蒲公英組，每組平行6個孔。置于37℃、5%CO2培養箱中培養。24 h后取出96孔板，置于超凈工作臺上，吸棄96孔板中舊培養液，PBS清洗各孔兩次后，加入無血清培養液，然后每孔滴入MTS 20 μl，37℃孵育4 h。用酶標儀在波長490 nm條件下檢測。

1.5 用Transwell小室檢測蒲公英對胃癌BGC823細胞遷移、侵襲作用的影響

1.5.1 細胞處理 實驗前一天，將對照組細胞培養液更換為無胎牛血清的RIPM-1640培養液，實驗組細胞培養液更換為含2.5 mg/ml蒲公英的無胎牛血清RIPM-1640培養液，37℃，5% CO2培養。24 h后，以胰蛋白酶消化細胞，分別制成2×105/ml的細胞懸液。

總之，在大數據時代，新媒體與傳統媒體的融合是媒體發展的必然過程。只有明確媒體融合的目的，提高媒體工作者的全媒體能力，并對媒體渠道進行有效的融合，才能真正促進媒體行業良好高速的發展。

1.5.2 腫瘤遷移實驗 24孔細胞培養板的孔中預先加入完全培養液（500 μl/孔），將預處理Transwell小室置于孔中，把已制好的對照組、實驗組細胞懸液分別加入Transwell小室的上室（100 μl/孔、2×104/孔）。將24孔細胞培養板37℃，5%CO2培養24 h。

1.5.3 腫瘤侵襲實驗 將10%人工基質膠均勻鋪于Transwell小室上室中，4℃靜置1 h。在24孔細胞培養板的孔中預先加入完全培養液（500 μl/孔），將鋪好基質膠的Transwell小室置于孔中，把已制好的對照組、實驗組細胞懸液分別加入Transwell小室的上室（100 μl/孔、2×104/孔）。將24孔細胞培養板37℃，5%CO2培養24 h。

1.5.4 結晶紫染色計數 培養24 h后，將Transwell小室輕輕取出，輕柔擦去小室上室殘留的細胞懸液，用結晶紫對小室膜的下室進行染色。染色后鏡檢，每個小室鏡下隨機選取5個視野，進行拍照并計數。

遷移/侵襲下降率=（對照組遷移或侵襲細胞數-實驗組遷移或侵襲細胞數）÷對照組遷移或侵襲細胞數×100%。

1.6 熒光實時定量PCR

1.6.1 細胞總RNA提取及反轉錄 將生長良好的胃癌BGC823細胞接種在細胞培養瓶中，分為空白對照組（0.0 mg/ml）、1.0 mg/ml蒲公英組、2.5 mg/ml蒲公英組。待細胞生長到鋪滿70%瓶底時，加入相應的細胞培養液，37℃，5%CO2培養。24 h后按Trizol總RNA提取試劑盒說明書分別提取3組細胞總RNA，并將RNA反轉錄為cDNA，置于-20℃備用。

1.6.2 熒光實時定量PCR 根據GenBank中公布的基質金屬蛋白酶2（MMP2）基因序列（NM_001127891）設計定量PCR特異引物，F：gatggcatcg ctcagatccg、R：tcaggccaga atgtggccac。采用SYBR Green I*嵌合熒光法進行實時定量PCR，擴增目的基因和內參基因。反應體系 10 ul：SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）5 ul，正向引物0.5 ul，反向引物0.5 ul，cDNA 1.0ul，ddH2O 3.0 ul。反應條件：95℃，2 min，一個循環；95℃，5 s，60℃，30 s，40個循環；溶解曲線分析65℃～95℃。每個樣品均設有3個復孔。

2 結果

2.1 蒲公英對胃癌BGC823細胞增殖的影響

MTS實驗結果顯示，1.0 mg/ml蒲公英組抑瘤率為-50.76%、

2.5 mg/ml蒲公英組抑瘤率為11.27%，有顯著性差異（P＜0.05），見圖1。

圖1 蒲公英對胃癌BGC823細胞增殖的影響

2.2 蒲公英對胃癌BGC823細胞遷移作用的影響

處理后的細胞經Transwell遷移小室培養24 h后，鏡下觀察結晶紫染色結果，對照組遷移數為362個，2.5 mg/ml蒲公英組為234個，有顯著性差異（P＜0.05），見圖2、圖3。

圖2 Transwell小室檢測胃癌BGC823細胞遷移作用結果

圖3 蒲公英對胃癌BGC823細胞遷移作用的影響

2.3 蒲公英對胃癌BGC823細胞侵襲作用的影響

處理后的細胞經Transwell侵襲小室培養24 h后結晶紫染色，結果顯示，對照組侵襲細胞數為266個，2.5 mg/ml蒲公英組侵襲細胞數為183個，有顯著性差異（P＜0.05），見圖4、圖5。

圖4 Transwell小室檢測胃癌BGC823細胞侵襲作用結果

圖5 蒲公英對胃癌BGC823細胞侵襲作用的影響

2.4 熒光實時定量PCR結果

熒光實時定量PCR結果顯示，1.0 mg/ml蒲公英組的MMP2相對量為0.82，2.5 mg/ml蒲公英組的MMP2相對量為0.35，有顯著性差異（P＜0.05），見圖6。

圖6 熒光實時定量PCR結果

3 討論

近年來中藥在臨床腫瘤治療方面取得了長足進步，無論是在增強免疫還是在整體調節方面，都顯出其較化療藥物的優勢［3］。現代研究表明，蒲公英的藥理活性多樣，具有抗菌消炎、消腫散結、抗氧化及抗腫瘤等作用。蒲公英主要含有胡蘿卜素類、脂肪酸類、三枯類、香豆素類、黃酮類及酚酸類化合物。其中，發揮藥理活性的主要成分為黃酮類化合物［4，5］。具有抗腫瘤作用的黃酮類化合物有蘆丁、水飛薊素、柚皮苷和槲皮素等。其抗癌、防癌機制可能與抑制自由基和致癌因子的產生、抑制腫瘤血管生長以及提高機體免疫力等有關［6］。也有研究顯示蒲公英的多糖成分具有很好的抗腫瘤作用，其機制與促進腫瘤細胞凋亡有關［7］。胃癌的發病率及死亡率在惡性腫瘤中位居前列，導致死亡的主要原因是發生浸潤增生與遠處轉移，在轉移過程中，發揮功能的大部分是基質金屬蛋白酶（MMP）［8］，而MMP2基因的表達調控在腫瘤細胞遷移和侵襲中起著主要作用［9］。本實驗選用濃度為2.5 mg/ml蒲公英的細胞培養液處理胃癌BGC823細胞24 h后，Transwell小室檢測結果顯示，與對照組相比，處理過的胃癌BGC823細胞遷移及侵襲能力均呈下降趨勢；定量PCR結果表明，經蒲公英處理過的胃癌BGC823細胞MMP2基因表達下降，并隨蒲公英濃度的增加而降低。提示蒲公英可抑制胃癌BGC823細胞的遷移、侵襲作用，其機制可能與蒲公英下調MMP2基因表達有關。作為一種無毒且具有多種活性的抗腫瘤藥物，蒲公英極具開發潛力，但其是否能作為治療腫瘤的臨床藥物，還需進行深入、系統的研究。

［1］Park C M，Park J Y，Noh K H，et al.Taraxacum officinale Weber extracts inhibit LPS-induced oxidative stress and nitric oxde oruduction via NF-kappaB modulation in RAW 264.7 cells ［J］.Ethnopharmacol，2011，133（2）：834-842.

［2］Jeon H J，Kang H J，Jung H J，et al.Anti-inflammatory activity of Taraxacum officinale［J］.Ethnopharmacol，2008，115（1）：82-88.

［3］Parekh H S，Liu G，Wei M Q.A new dawn for the use of traditional Chinese medicine in cancer therapy［J］.Mol Cancer，2009（8）：21.

［4］衛建琮，李華峰，喬華，等.中藥蒲公英花中總黃酮的分離純化研究［J］.中國藥物與臨床，2014，14（1）：19-21.

［5］楊嵐，李華峰，刁海鵬，等.蒲公英花中總黃酮和總酚酸含量測定及其抗氧化性能研究［J］.食品科學，2011，17（32）：160-163.

［6］Vanhees K，de Bock L，Godschalk R W，et a1.Prenatal exposure to flavonoids：implication for cancer risk［J］.Toxicol Sci，2011，120（1）：59-67.

［7］Ghavami S，Hashemi M，Ande S R，et al.Apoptosis and cancer：mutations within caspase genes［J］.Med Genet，2009（46）：497-510.

［8］Kai Kessenbrock，Vicki Plaks，Zena Werb.Matrix Metalloproteinases：Regulators of the Tumor Microenvironment［J］.Cell，2010（141）：52-67.

［9］Lee Y H，Albig A R，Regner M，et al.Fibulin-5 initiates epithelialmesenchymal transition（EMT）and enhancesEMT induced by TGF-beta in mammary epithelial cells via a MMP-dependent mechanism［J］.Carcinogenesis，2008，29（12）：2243-2251.

R735.2

B

1671-1246（2015）09-0142-03