不同種群比格犬單核細胞、T淋巴細胞檢測

劉　宏， 王　冰， 黃　凱， 項路娟， 孫紅梅， 尹燕博，

（1. 青島農業大學， 青島 266109； 2. 青島大學醫學院， 青島 266071；3. 青島博隆實驗動物有限公司， 青島 266225）

不同種群比格犬單核細胞、T淋巴細胞檢測

劉宏1， 王冰2， 黃凱3， 項路娟3， 孫紅梅3， 尹燕博1，3

（1. 青島農業大學， 青島 266109； 2. 青島大學醫學院， 青島 266071；3. 青島博隆實驗動物有限公司， 青島 266225）

目的 檢測3個種群健康成年比格犬外周血單核細胞及T淋巴細胞免疫表型分布，建立相應的正常參考范圍。方法 選擇三個種群健康成年比格犬： Charles River（大體型）、Covance（中體型）、自繁（小體型）各30只，血樣用三色特異性T淋巴細胞亞群及單色單核細胞熒光抗體進行熒光標記，流式細胞儀檢測CD14、CD3、CD4、CD8標記的樣品。結果 （1）外周血白細胞中單核細胞占比大體型比格犬明顯高于其他兩組（P＜0.05）； （2）CD4+淋巴細胞在T淋巴細胞中占比大體型比格犬明顯高于其他兩組（P＜0.05）； CD8+淋巴細胞在T淋巴細胞中的占比中體型比格犬明顯高于其他兩組（P＜0.05）； CD4+/CD8+小體型明顯高于其他兩組（P＜0.05）。結論 大體型比格犬自身免疫能力比較強，小體型比格犬具有數據比較穩定、體型小、容易操作等優點。建立了不同種群比格犬的淋巴細胞免疫表型及單核細胞的參考范圍。

比格犬； 單核細胞； T淋巴細胞； 流式細胞術； 免疫細胞

隨著艾滋病、自身免疫疾病及各種腫瘤的發病率上升，人們對這些疾病的發病機理、病程發展、治療效果的研究不斷深入，研究表明疾病的發生與機體免疫功能狀態密切相關［1，2］。

目前主要以小鼠模型來研究人類疾病，但小鼠生命周期短，不適合作為慢性疾病模型，利用犬作為動物模型則克服了小鼠的上述缺點［3］。在國內外的科研工作中，比格犬被廣泛應用于醫學、生物學、病理學、腫瘤學、免疫學、藥理學、生物化學等生命科學領域［4］。比格犬對于闡明人類相關疾病的發生機制、篩選治療藥物并最終控制和治療人類疾病方面無疑是很好的動物模型。

但在正常情況下，比格犬外周血淋巴細胞亞群及單核細胞的變化規律怎樣？特別是不同種群比格犬的相應指標是否一致，目前還沒有相關文獻報道。本文目的是建立正常比格犬各個種群的外周血淋巴細胞免疫表型及單核細胞正常參考范圍，為動物模型的建立奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物

12月齡以上Charles River（大體型）、Covance（中體型）、自繁（小體型）比格犬各30只， 雌雄各半，體質量分別為17～23 kg、13～17 kg和9～12 kg，均由青島博隆實驗動物有限公司提供［SCXK（魯）2012-0003］。

1.2儀器與試劑

水平離心機（TD5A， 湖南赫西儀器裝備有限公司）、渦旋振蕩器（SK-1， 上海梅香儀器有限公司）、流式細胞儀（Accuri C6，美國BD公司）； FITC標記的CD14鼠抗犬單抗、APC標記的CD3鼠抗犬單抗、PE標記的CD4鼠抗犬單抗、FITC標記的CD8鼠抗犬單抗、溶血素等均為美國BD公司的產品。

1.3方法

每只比格犬前肢內側靜脈處采抗凝血2 mL，均在6 h內處理樣品。 取100 μL抗凝全血加入每支試管中，注意不要碰到管壁。輕輕混勻，加入20 μL熒光抗體，室溫避光保存20 min。取出試管，每管加入10倍稀釋的溶血素2 mL， 渦旋混勻，避光10 min， 300×g離心5 min， 棄去上清液。每管加入2 mL PBS，渦旋混勻， 300×g離心5 min，棄去上清液。然后加入0.5 mL PBS混勻，4 ℃避光1 h內上機檢測。

1.4統計分析

將有效數據導入電腦， 采用SPSS 17.0 軟件包和Excel進行統計分析。數據以±s表示，多組間的比較用方差分析，兩兩比較用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1單核細胞

不同種群比格犬間單核細胞在白細胞中占比有顯著性差異（P＜0.05）（表1）。大體型比格犬單核細胞數量最多。

2.2T淋巴細胞

不同種群比格犬CD4+、CD8+細胞在T淋巴細胞中占比有顯著性差異（P＜0.05），大體型與小體型及中體型與小體型比格犬間CD4+/CD8+有顯著性差異（P＜0.05）， 大體型與中體型間無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

2.5非單核細胞系、非淋巴細胞系

不同種群比格犬非單核細胞系、非淋巴細胞系間無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

表1　不同體型成年健康比格犬外周血CD14+單核細胞、T淋巴細胞等檢測結果 %

3　討論

健康比格犬外周血淋巴細胞亞群正常參考范圍建立，是監測和評價機體免疫功能的基礎，對疾病診斷分期、治療評價、預后判斷有重要指導意義。利用各種單克隆抗體與淋巴細胞表面的抗原結合， 再配合多色熒光染料， 通過流式細胞儀檢測分析即可以把各種不同功能的淋巴亞群區分開來，進而得到各亞群的相對比例［5，6］。最常檢測的細胞包括T細胞（CD3）、單核細胞（CD14）、輔助性T細胞（CD3+、CD4+）和抑制性T細胞（CD3+、CD8+）等［7］。淋巴細胞是機體免疫細胞中構成免疫系統和發揮適應性免疫應答，執行免疫功能主要細胞群體［8］。對淋巴細胞亞群的檢測現已廣泛應用于腫瘤、艾滋病和自身免疫病的診斷、治療及預后［9］。此外，外周血單核細胞在機體免疫防御和固有免疫應答中發揮重要作用。單核細胞除了抵御侵入體內的病原體外，還能吞噬和清除機體代謝過程中不斷產生的衰老、死亡或惡變細胞以及頹變物質等，從而維持內環境穩定［11］。進行淋巴細胞亞群及單核細胞的分析，對于了解機體免疫功能狀態有重要的臨床意義。單核細胞來源于骨髓細胞的多功能干細胞。單核細胞是機體重要的殺傷腫瘤細胞的免疫細胞，是樹突狀細胞和巨噬細胞的前體細胞。具有吞噬殺傷、呈遞抗原啟動免疫應答、抗腫瘤、調節免疫等作用［11］。單核細胞表達高水平的CD14分子，是較為特異的表面標志［12］。目前有多種T細胞分類法，按T細胞表面是否存在CD4和CD8分子進行分類，可將T細胞分為T4細胞和T8細胞。CD3是比較特異的T細胞抗體，表達于所有T細胞表面；CD4+T細胞具有輔助、誘導細胞及體液免疫的作用； CD8+細胞具有細胞毒效應，也發揮抑制細胞及體液免疫的作用［13］。CD8+T細胞計數能反映機體抗病毒能力。外周血中CD4+T細胞與CD8+T細胞的比值可以評估淋巴細胞的功能，CD4總數升高提示淋巴細胞活性增加，因為輔助性細胞占優勢， 而CD8總數升高則提示淋巴細胞活性降低［14］。

本研究選擇比格犬的三個種群分別為大體型、中體型和小體型。大、中、小體型比格犬的體質量分別為： 17～23 kg、13～17 kg、9～12 kg。大體型、中體型比格犬有詳細的遺傳圖譜，小體型是在以上兩種體型的基礎上自繁自育形成體型較小的比格犬。單核細胞在機體免疫防御和固有免疫應答中發揮重要的作用。不同體型間在外周血單核細胞、粒細胞、淋巴細胞在白細胞中占比的比較中，大體型單核細胞在白細胞中占比最高，小體型比格犬單核細胞在白細胞中占比僅次于大體型比格犬單核細胞在白細胞中的占比，中體型比格犬單核細胞在白細胞中的占比最低。

在日常飼養管理中， 大體型和小體型比格犬的成活率較高， 抵抗能力較強， 而中體型比格犬在相同的飼養條件下成活率最低， 抵抗力較弱， 此現象與研究結果相符合。淋巴細胞亞群分類占比中小體型成年健康比格犬數據比較穩定更接近于人類的占比。

參考人類外周血細胞流式物理參數圖［15］并結合本研究得出非淋巴細胞系、非單核細胞系是粒細胞系并且比格犬的單核細胞要比淋巴細胞小。而夏兆飛等［16］在《犬貓血液學手冊》中提到犬單核細胞大小為15～20 μm，淋巴細胞為9～12 μm，即單核細胞要比淋巴細胞大，與本研究結果不一致。單核細胞比淋巴細胞小，是否為比格犬所特有，有待進一步研究。張改平等［17］提到犬類T淋巴細胞在白細胞中占比為46%～72%； CD4+T細胞在淋巴細胞中占比為27%～33%； CD8+T細胞在淋巴細胞中占比為17%～18%； CD4+/CD8+比值為1.7，而本研究中CD4+T細胞在白細胞中占比及CD4+/CD8+比值均比上述中要高，具體原因有待進一步研究。周祥吉等［18］提到24只南方雜種犬的數據與本研究小體型比格犬的數據相符。

總之，此次試驗成功建立了健康比格犬不同種群外周血T淋巴細胞亞群及單核細胞的正常參考范圍，對相關應用研究有一定參考意義。

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Q95-33

B

1674-5817（2015）06-0495-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.013

2015-05-16

“十二五”農村領域國家高技術研究發展計劃（863）項目（2012AA101303）

劉宏（1988-）， 女， 碩士， 主要從事預防獸醫學研究。 E-mail： liuhong_22188@163.com

尹燕博。E-mail： yanboyin2011@163.com；王冰。E-mail： wangbing@qdu.edu.cn