1，25-二羥基維生素D3對鏈脲佐菌素致胰島素瘤細胞損傷的保護與修復作用

何大偉， 倪程佩， 王禹斌， 王　婧， 周正宇

（蘇州大學實驗動物中心， 蘇州 215123）

1，25-二羥基維生素D3對鏈脲佐菌素致胰島素瘤細胞損傷的保護與修復作用

何大偉， 倪程佩， 王禹斌， 王婧， 周正宇

（蘇州大學實驗動物中心， 蘇州 215123）

目的 初步探討1，25-二羥基維生素D3（1，25-（OH）2D3）對鏈脲佐菌素（STZ）所致大鼠胰島素瘤（INS-1）細胞損傷的保護與修復作用。方法 將INS-1細胞接種于培養板中，置于CO2培養箱中進行培養，藥物干預后，應用細胞計數試劑盒（CCK8）檢測細胞增殖活力，ELISA法分別檢測培養液中的胰島素濃度、丙二醛（MDA）濃度和總抗氧化能力（T-AOC）。結果 1，25-（OH）2D3可以促進INS-1細胞的活力和胰島素的分泌（P＜0.01）。STZ所致模型組的細胞活力降低（P＜0.001），胰島素分泌量減少（P＜0.01），MDA含量明顯升高（P＜0.01），T-AOC能力下降（P＜0.01）。與STZ組比較，1， 25-（OH）2D3保護組與修復組在不同程度上改善了上述指標（P＜0.01）。結論 1，25-（OH）2D3可以促進INS-1細胞分泌胰島素，對STZ損傷的胰島細胞具有一定的保護與修復作用。

1， 25-二羥基維生素D3（1， 25-（OH）2D3）； 胰島素瘤（INS-1）細胞； 鏈脲佐菌素（STZ）； 胰島素

隨著世界人口老齡化，糖尿病已成為一種常見病和多發病，嚴重危害人類健康。近年來，隨著人們對維生素D的不斷深入研究，發現維生素D缺乏與Ⅰ型糖尿病及Ⅱ型糖尿病有一定聯系， 長期補充維生素D可以降低這些疾病發生的風險［1-3］，但具體作用機制尚未闡明。大鼠胰島素瘤（INS-1）細胞是一種來自大鼠胰島素瘤的細胞株，可以穩定地分泌胰島素，是研究胰島細胞功能的理想細胞［4］。本實驗應用維生素D的活性形式1， 25-二羥基維生素D3（1， 25-（OH）2D3），觀察其對鏈脲佐菌素（STZ）致INS-1細胞損傷的保護和修復作用，并初步探討其作用機制，為維生素D預防和治療糖尿病提供一定的實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

INS-1細胞， 購自上海拜利生物科技有限公司；1， 25-（OH）2D3、鏈脲佐菌素（STZ）和β-巰基乙醇均購自Sigma公司，RPMI 1640培養基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶均購自Gibco公司，大鼠胰島素檢測試劑盒、丙二醇（MDA）和總抗氧化（T-AOC）試劑盒均購自上海滬尚生物科技有限公司，細胞計數試劑盒（CCK8）購自DOJINDO公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養使用含體積分數為10%的胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1 mmol/L丙酮酸鈉，50 μmol/L β-巰基乙醇， 1×105IU/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPMI 1640培養基培養INS-1細胞。從液氮取出凍存的細胞迅速放入37 ℃恒溫水浴鍋，快速搖晃凍存管使之在2 min內融化。然后，用酒精棉球擦拭凍存管外周后拿進超凈臺，將細胞懸液轉至含有4 mL 1640完全培養基的15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min后，棄上清，加入10 mL 1640完全培養基混勻后，轉移到直徑為10 cm的培養皿中， 并置于37℃， 5% CO2飽和濕度的恒溫箱中培養。觀察細胞狀態， 每2 d換液一次，待細胞長至60%～80%時，棄去培養基，PBS 洗2次， 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min后， 加完全培養基終止消化， 將細胞懸液以1 000 r/min，離心5 min后，按1∶3進行傳代。

1.2.2CCK8檢測細胞活力將濃度7×105個/mL 的INS-1細胞接種至96孔板，100 μL/孔，每組6個重復孔，在培養箱中培養18 h后進行藥物干預，待藥物干預結束后，每孔加入10 μL CCK8，孵育1～3 h后，用全自動酶標儀測450 nm波長時各孔的D值。

1.2.3葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）棄去培養液， 用PBS洗滌各組細胞2次， 加入含2.8 mmol/L葡萄糖的克-林二氏重碳酸鹽（KRB）緩沖液孵育1 h，再更換為含有20 mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液孵育1 h后，收集上清。胰島素分泌水平的測定根據ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，最后計算出胰島素在高糖刺激后的分泌水平與基礎狀態分泌水平的比值。

1.2.4不同濃度的1，25-（OH）2D3對INS-1細胞的胰島素分泌和細胞活性的影響將濃度7×105個/mL 的INS-1細胞隨機分為正常對照組、1，25-（OH）2D3組（包含10-6mmol/L組、10-7mmol/L組、10-8mmol/L組、10-9mmol/L組）分別接種于24孔板和96孔板，每組6個重復孔，待細胞完全貼壁后，加入不同濃度的1，25-（OH）2D3，繼續培養24 h后，分別測定GSIS和細胞活力。

1.2.51，25-（OH）2D3對STZ致INS-1細胞損傷的影響使用上述方法將INS-1接種培養板， 并隨機分為正常對照組、STZ 5 mmol/L組、保護組［1，25-（OH）2D3 10-7mmol/L+STZ 5 mmol/L］、修復組（STZ 5 mmol/L+ 1，25-（OH）2D310-7mmol/L）， 每組6個重復孔。待細胞完全貼壁后， 保護組先加入濃度為10-7mmol/L 1，25-（OH）2D3培養24 h，再加入5 mmol/L的STZ培養3 h； 修復組先加入5 mmol/L的STZ作用3 h后，再加入濃度為10-7mmol/L 1， 25-（OH）2D3培養24 h； STZ組加入5 mmol/L的STZ作用3 h。干預結束后，分別測定各組胰島素的分泌水平和細胞活力， MDA的生成和T-AOC能力的檢測根據ELISA檢測試劑盒說明書進行操作。

1.3統計學分析

所有數據均采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。每組實驗都獨立重復3次。

2　結果

2.1不同濃度的1，25-（OH）2D3對INS-1細胞胰島素分泌和細胞活性的影響

基礎葡萄糖狀態下， 各組細胞分泌的胰島素水平和細胞活性無顯著差異， 高糖狀態下， 10-7mmol/L 的1，25-（OH）2D3處理組的INS-1細胞分泌的胰島素水平明顯增加（P＜0.01）（表1）； 且10-7mmol/L組的INS-1細胞活性最高（P＜0.01）（表2）。

2.21，25-（OH）2D3對STZ致INS-1細胞損傷的影響

基礎和高糖狀態下， STZ組的INS-1細胞分泌的胰島素水平和細胞活性明顯低于正常對照組；而保護組和修復組的INS-1細胞分泌的胰島素水平和細胞活性較STZ組有明顯的增加（表3， 表4）。與正常對照組相比， STZ組的MDA生成量升高， T-AOC能力下降； 而與STZ組相比， 保護組和修復組的MDA生成量明顯下降，T-AOC能力顯著升高（表5）。

表1　不同濃度的1，25-（OH）2D3對INS-1細胞胰島素分泌的影響Table 1 Effects of different concentrations of 1，25-（OH）2D3 on insulin secretion of INS-1 cells

表2　不同濃度的1，25-（OH）2D3對INS-1細胞活性的影響Table 2 Effects of different concentrations of 1，25-（OH）2D3 on cell viability of INS-1 cells

表3　1，25-（OH）2D3對STZ致INS-1細胞損傷的胰島素分泌的影響Table 3 Effects of 1，25-（OH）2D3 on insulin secretion of INS-1 cells damaged by STZ

表4　1， 25-（OH）2D3對STZ致INS-1細胞損傷的細胞活性的影響Table 4 Effects of 1， 25-（OH）2D3 on cell viability of INS-1 cells damaged by STZ

表5　1，25-（OH）2D3對INS-1細胞MDA生成和T-AOC能力的影響Table 5 Effects of 1，25-（OH）2D3 on the production of MDA and capacity of T-AOC of INS-1 cells

3　討論

維生素D除其傳統作用外，越來越多的新功能已被人們認知。缺乏維生素D不僅影響免疫系統，還可以導致胰島細胞功能紊亂； 重度佝僂病患者體內的胰島素合成明顯減少，表現為明顯的胰島素缺乏癥［5］。維生素D在葡萄糖/胰島素代謝中發揮著重要作用［6］，是維持胰島結構和功能正常所必不可少的因素［7］， 本實驗結果進一步證實了此觀點。

氧化應激（oxidative stress）是指機體組織或細胞內氧自由基生成增加或清除能力下降，導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）在體內或細胞內蓄積而引起的氧化損傷過程［8］。ROS會攻擊生物膜不飽和脂肪酸形成脂質過氧化物，其產物MDA是一種有害物質，可作為評價脂質過氧化反應強弱的指標［9］； T-AOC是反應組織抗氧化能力的重要指標之一。與其他組織細胞相比，胰島細胞缺乏抗氧化酶類，易受氧化應激損傷［10，11］，抗氧化能力較弱，對活性氧更加敏感。胰島細胞損傷和功能異常是糖尿病發生的主要原因。ROS可以損傷胰島細胞的細胞核和線粒體，導致胰島素分泌水平下降，細胞凋亡增加［12］。而STZ可以直接產生ROS，被廣泛用于制作糖尿病模型［13］。越來越多的研究結果顯示，氧化應激與糖尿病及其并發癥的發生發展關系密切。本實驗結果顯示，STZ損傷組的細胞活力和胰島素分泌都明顯受到抑制，同時MDA顯著上升，T-AOC明顯下降； 與STZ組比較，保護組和修復組的細胞活力和胰島素分泌水平均上升，細胞活性升高，而MDA水平下降，T-AOC水平上升，結果表明1，25-（OH）2D3能有效的保護和修復STZ引起的胰島細胞損傷，恢復胰島細胞的功能，其機制可能是通過抑制脂質過氧化物的生成，提高細胞的總抗氧化能力。

維生素D對于糖尿病的影響機制目前尚未完全闡明，本實驗結果表明1，25-（OH）2D3可以在體外試驗中提高胰島細胞的活力、促進胰島素分泌和改善氧化應激作用，但仍需要更多的動物體內實驗和相關的臨床研究進行驗證。

［1］張黎明， 龍艷， 蘇珂. 維生素D與糖尿病［J］. 廣東醫學， 2013，34（8）：1300-1302.

［2］Wolden-Kirk H， Overbergh L， Christen HT， et al. Vitamin Dand diabetes： its importance for beta cell and immune function ［J］. Mol Cell Endocrinol， 2011， 347（1/2）：106-120.

［3］Kurt O， Balta S， Cakar M， et al. The protectiveness of the treatment of vitamin D insufficiency in the development of diabetes［J］. Arq Bras Endocrinol Metabol， 2013， 57：157-8.

［4］Xu GL， Chen JQ， Gu J， et al. Preventing β-Cell Loss and Diabetes With Calcium Channel Blockers［J］. Diabetes， 2012，61（4）：848-856.

［5］Giulietti A， Gysemans C， Stoffels K， et al. Vitamin D deficiency in early life accelerates Type 1 diabetesin non-obese diabetic mice［J］. Diabetologia， 2004， 47（3）：451-462.

［6］Holick MF. The D-lightful vitamin D for child health［J］. JPEN J Parenter Enterai Nutr， 2012， 36（1 suppl）：9S-19S.

［7］Afzal S， Brondum-Jacobsen P， Bojesen SE， et al. Vitamin D concentration， obesity， and risk of diabetes： a mendelian randomisation study［J］. Lancet Diabetes Endocrinol， 2014，2（4）： 298-306.

［8］宋影芳， 賴國祥， 戚好文， 等. 1，25-二羥基維生素D3減輕哮喘小鼠的氣道重塑［J］. 基礎醫學與臨床， 2011， 31（9）：1021-1025.

［9］Kaneto H， Nakatani Y， Kawamori D， et al. Role of oxidative stress， endoplasmic reticulum stress， and c-Jun N-terminal kinase in pancreatic beta-cell dysfunction and insulin resistance ［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2006， 38（5-6）：782-793.

［10］ Maiese K， Morhan SD， Chong ZZ. Oxidative stress biology and cell injury during type 1 and type 2 diabetes mellitus［J］. Curr Neurovasc Res， 2007， 4（1）：63-71.

［11］ Du SC， Ge QM， Lin N， et al. ROS-mediated lipopolysaccharide-induced apoptosis in INS-1 cells by modulation of Bcl-2 and Bax［J］. Cell Mol Biol （Noisy-le-grand）， 2012， 58 Suppl：OL1654-1659.

［12］ Miyazaki Y， Kawano H， Yoshida T， et al. Pancreatic B-cell function is altered by oxidative stress induced by acute hyperglycaemia［J］. Diabet Med， 2007， 24（2）：154-160.

［13］ 金經， 羅佐杰. 氧化應激對胰島β細胞影響的研究進展［J］. 山東醫藥， 2009， 49（37）：108-109.

Protective and Repairing Effects of 1，25 - dihydroxy Vitamin D3 on STZ induced INS-1 Cells Damage

HE Da-wei， NI Cheng-pei， WANG Yu-bin， WANG Jing， ZHOU Zheng-yu
（Laboratory Animal Center of Soochow University， Suzhou 215123， China）

Objective To explore the protection and repair effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3 on STZ-induced INS-1 cells damage. Methods After inoculating the INS-1 cells into the culture plates，the proliferation activity of the cells was measured by CCK8 method. Secreted insulin and malondialdehyde （MDA） concentration， total anti-oxidation capability （T-AOC） in the culture medium were measured by ELISA. Results 1，25-dihydroxyvitamin D3 improved the viability and insulin secretion of the INS-1 cells（P＜0.01）. The cell proliferation （P＜0.001）， insulin secretion （P＜0.01） and T-AOC （P＜0.01） of the STZ group decreased， and the MDA content （P＜0.01） significantly increased Compared with the STZ group， the protection and repairation group of 1，25-dihydroxyvitamin D3 can improve the above index in different degrees（P＜0.01）. Conclusions 1，25-dihydroxy vitamin D3 improved the insulin secretion of the INS-1 cells and had significantly protection and repair effects on the INS-1 cells damaged by STZ.

1，25-dihydroxyvitamin D3； Insulinoma （INS-1） cells； Streptozotocin （STZ）； Insulin

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0458-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.006

2015-03-15

江蘇省自然科學基金（BK20151217）

何大偉（1987-）， 男， 蘇州大學醫學部2012級碩士研究生。E-mail： 645836427@qq.com

周正宇（1973-）， 男， 副教授， 主要從事比較醫學研究。E-mail： zacharyzhou@suda.edu.cn