肺不張后復張小型豬肺泡表面活性物質A的表達及CT比較

涂軍偉， 王賽斌， 盛怡俊， 陳慧君， 田江華， 盛　琳， 應明亮， 胡　斌， 何忠平

（1. 金華市中心醫院呼吸科， 金華321000； 2. 金華市中心醫院影像科， 金華321000；3. 金華市中心醫院病理科， 金華321000； 4. 金華市食品藥品檢驗所， 金華321000）

肺不張后復張小型豬肺泡表面活性物質A的表達及CT比較

涂軍偉1， 王賽斌1， 盛怡俊1， 陳慧君1， 田江華1， 盛琳1， 應明亮2， 胡斌3， 何忠平4

（1. 金華市中心醫院呼吸科， 金華321000； 2. 金華市中心醫院影像科， 金華321000；3. 金華市中心醫院病理科， 金華321000； 4. 金華市食品藥品檢驗所， 金華321000）

目的探討肺不張后復張過程中小型豬肺泡表面活性物質A（SPA）的表達及多層螺旋計算機斷層掃描（CT）影像學變化。方法采用18只中國實驗用小型豬I系為實驗動物，在支氣管鏡下置入封堵器造成肺不張模型，分別在肺不張后3 d、1周及2周取出封堵器，運用CT觀察各組肺復張情況，在取出封堵器后2周取實驗肺組織，采用免疫組織化學檢測SPA的表達。結果SPA在肺不張2周組表達下降，與3 d組、1周組比較存在統計學差異（P＜0.05）。CT下比較3組單側肺不張面積無統計學差異（P＞0.05），而在復張過程中，3 d組殘留肺不張面積最少，與1周組、2周組比較存在統計學差異（P＜0.05）。取出封堵器后，肺不張1周、2周組之間CT弧度值無明顯差異（P＞0.05），但均高于3 d組（P＜0.05）。結論肺復張后SPA表達隨肺不張時間延長而減少；肺不張后肺復張CT影像學改善取決于發生肺不張時間，此時間在一周內為佳。

肺不張； 復張； 肺泡表面活性物質A（SPA）； 計算機斷層掃描（CT）； 弧度值

任何原因引起的肺組織不含氣或含氣量減少，以致肺組織萎陷，體積縮小，稱作肺不張（Atelectasis）。肺不張不是一個獨立的疾病名稱，是由多種疾病所引起的一種病理形態學改變。近年來肺不張的病因、診斷及治療方面均有重大突破，大部分肺不張患者經治療后能復張。然而，關于肺不張后肺復張所需時間及復張過程中影像學動態變化及相關機制研究未見報道。本研究通過建立肺不張后復張動物模型，研究不同時期肺不張在解除不張后肺泡表面活性物質A（SPA）的表達、影像學動態變化和組織病理學改變，初步探討了治療肺不張的最佳時機。

1　材料與方法

1.1實驗動物

1.2主要儀器及試劑

XZ-3型纖維支氣管鏡（上海）； H-600型透射電鏡（HITACH，Japan）； 16排螺旋CT（西門子）； 鎳鈦合金封堵器購自上海形狀記憶合金材料有限公司。SPA多克隆兔抗豬一抗、鼠抗兔二抗及其他免疫組織化學用試劑購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.3模型建立

小型豬麻醉前10 h禁食不禁水，氯胺酮針劑8～10 mg/kg肌肉內注射全身麻醉， 小型豬約10 min后站立不穩，抬置活動操作臺上束縛固定，配合體積分數為2%利多卡因局部浸潤和氣道黏膜表面麻醉，丙泊酚針全身麻醉。按以下步驟操作： ①纖支鏡經鼻插入達右主支氣管下端，沿支氣管鏡活檢工作孔道將導引鋼絲送入靶位支氣管腔內，留置導絲退出支氣管鏡。②改用外徑為3.2 mm的纖維支氣管鏡， 從另一鼻孔插入， 并伸至擬封堵的靶位支氣管上方， 以監視整個封堵器的置人和釋放。③將外鞘沿導引鋼絲送入到擬封堵的靶位支氣管上方， 調整外鞘管至最佳位置后， 固定外鞘管退出導絲。④將收攏的連接有推送桿的鎳鈦合金封堵器沿外鞘管腔內送至靶區后， 直視下將封堵器釋放至靶位，在確認封堵器處于最佳位置并待其充分膨脹后卸除推送桿，撤出推送桿和外鞘管，至此整個封堵過程完畢，退出支氣管鏡。

小型豬支氣管封堵成功后每3 d一次行胸部計算機斷層掃描（CT）檢查， 直至胸部CT顯示出現肺不張的表現。將已經造成肺不張的小型豬于形成肺不張后3 d、1周、2周， 在支氣管鏡下使用冰生理鹽水噴灑后將支氣管封堵器取出， 恢復支氣管通氣。并在取出后每3 d行胸部CT檢查觀察肺復張情況，直至2周結束。實驗末取實驗肺組織行相關檢測。

1.4實驗方法

1.4.1HE染色在設定時間點取實驗部位肺組織標本，質量分數4%多聚甲醛浸泡固定，常規石蠟包埋、切片，常規H E染色，光鏡檢查。

1.4.2SPA免疫組織化學檢測免疫組織化學組織切片脫蠟至水，微波抗原修復，加入SPA多克隆兔抗豬一抗后4 ℃過夜，加入鼠抗兔二抗，蘇木素復染，脫水、透明、封片，光鏡觀察。空白對照用PBS代替一抗，陽性對照為成人肺組織切片。以細胞胞質有棕黃色顆粒沉著為陽性細胞。陽性結果按下列方法分級： 無反應顆粒（-）； 陽性細胞分散且表達弱陽性（±）； 表達強度陽性（+）； 表達強度中等陽性（++）； 表達強陽性（+++）。SPA表達陽性細胞計數分組中每例標本各隨機抽取染色清晰的切片5張，每張切片于高倍鏡（×400） 隨機選取5個視野，固定窗口面積，進行細胞計數。

2017年，全市水產品總產量為6.77萬噸，其中養殖產量6.16萬噸，捕撈產量0.61萬噸。養殖品種為鰱、鳙、鯉、鯽、草、青、鳊魴等大宗魚類和黃顙魚、鱸、黃鱔、鱖、泥鰍、鯰、鮰等優質魚類，產量為6.00萬噸，蝦、龜鱉、大鯢等特色品種產量0.16萬噸。

1.4.3不同時期肺不張及復張CT檢查每組實驗動物在規定時間行CT橫斷面和冠狀面檢查，在同一橫斷面在規定時間測定各組CT弧度值（Hu）。每組取6個層面，每個層面計算5個CT Hu，測量值用取均數和標準差表示。在同一層面，分別測量每組肺不張面積占單側肺面積比值，復張后殘留肺不張面積占單側肺面積比值，用百分數表示。

1.5統計學分析

2　結果

2.1肺組織病理學觀察

正常肺組織肺泡壁結構較薄，肺泡內充滿空氣（圖1A）； 肺不張組織光鏡可見廣泛肺泡膨脹不全，肺泡壁塌陷，肺泡內無氣體，細支氣管壁完整，毛細血管擴張、出血，細支氣管和肺泡內充滿中性粒細胞和組織細胞（圖1B）。肺復張后上述不張改變明顯減輕，但可見少許肺間質纖維化（圖1C）。

2.2SPA表達

鏡下表現為肺泡上皮細胞胞漿呈棕色深染（圖2），肺不張3 d（圖2A）至1周（圖2B），SPA表達無明顯差異（P＞0.05），肺不張2周組（圖2C）SPA表達明顯下降，與肺不張3 d、1周組比較均有統計學差異（Z=-2.889， P=0.004； Z=-2.567， P=0.001， 表1）。

2.3肺不張CT表現

肺不張區域的CT弧度值增高，伴肺體積縮小、葉間胸膜移位，支氣管、血管聚集，鄰近組織氣管移位和代償性肺氣腫等， 可見空氣支氣管征（圖3A～C）。肺復張組上述情況明顯減輕，趨向正常， 或僅有少許密度增高病灶改變（圖4A～B）。3組在肺不張CT弧度值及肺不張占單側肺面積比較均無明顯差異（P＞0.05，表2、3）， 而在復張2周后，1周組、2周組CT弧度值及殘留肺不張占單側肺面積均明顯高于3 d組（P＜0.05，表2、3）。

表1　肺泡表面活性物質A免疫組織化學Table 1 Expression of pulmonary surfactant-associated protein A by immunohistochemistry

圖1　小型豬肺組織病理學觀察Figure 1 Pathological observation on lung tissue in minipig

圖2　小型豬SPA免疫組織化學Figure 2 Immunohistochemistry of pulmonary surfactant-associated protein A in minipig

圖3　小型豬CT冠狀位及橫斷位肺不張表現Figure 3 Coronal and conventional CT scanning image of atelectasis in minipig

圖4　小型豬CT肺復張表現Figure 4 CT scanning image of re-expansion after atelectasis in minipig

表2　不同時間肺不張及復張殘留不張區域面積百分比Table 2 Comparsion area of atelectasis with residual atelectasis after re-expansion with time %

表3　不同時間肺不張及肺復張CT弧度值Table 3 Comparison CT value of atelectasis with residual atelectasis after re-expansion with time %

3　討論

肺不張是臨床上常見的綜合征，如感染、異物、腫瘤、急性肺損傷、麻醉圍手術期［1］、機械通氣及溺水等均容易并發肺不張。近年來，在肺不張的病因、診斷及治療方面均有重大突破，如支氣管鏡下介入治療最為顯著。目前開展的介入治療包括：激光治療、微波治療、高頻電治療、氬等離子體凝固治療、冷凍治療、近距離放療、氣道支架治療、球囊擴張治療等［2-4］。目前對肺不張有較多研究［5，6］，但對于肺不張后肺復張的病理生理機制、治療時機的把握及治療策略的選擇，目前無可靠依據可循。為此，本研究旨在此方面作進一步研究和初步探討。

反應肺不張病理生理機制的動物模型已成功建立。國外有人在不同的動物種屬復制了急性肺不張模型，這些動物包括豬、兔、犬等［6-9］，但其研究出發點多著重于肺不張的早期診斷及各種干預對肺不張的影響。建立肺不張模型的方法各有不同，Ferrante等［7］使用福格蒂導管攜帶球囊使其擴張阻塞支氣管的方法復制肺不張模型， Comaru等［5］則通過導管在局部支氣管內注入人工粘液復制肺復張的模型， 其他方法包括葉支氣管的夾閉、氣管鏡下植入海綿栓等。此類動物模型在復制出肺不張后不能解除誘因，與臨床肺不張治療后肺復張的病例不同。中國實驗用小型豬的比較醫學研究表明： 豬在心血管系統、消化系統、皮膚結構、營養需要、礦物質代謝、多項生理生化值與人類有較大的相似性，豬用于人類疾病模型、藥物學、中醫學等多項領域研究優于其他實驗動物。本文作者借助纖維支氣管鏡在葉氣管內置入封堵器形成肺不張，然后在規定時間點取出封堵器致肺復張，成功復制了肺不張后復張的動物模型，該模型目前尚屬于首創，為今后肺不張后復張研究提供動物模型參考。

CT檢查是診斷肺不張最常規和有效的方法，普通的胸部X攝影不易發現，除非是大面積肺不張。CT上可見病變肺葉容積縮小且密度增高等。Strang等［10］提出肺不張胸部CT診斷標準： 通過測量弧度值Hu，肺部CT表現分成4種，-1 000 Hu到-850 Hu為過度充氣： -850 Hu 到-500 Hu為正常充氣；-500 Hu到-100 Hu為不全充氣； -100 Hu 到+100 Hu為肺不張。本文作者制作的2周內肺不張模型CT值處于20～30 Hu，符合上述標準，為臨床肺不張患者評估肺不張時間提供影像學參考。隨著發生肺不張時間延長，復張延緩，本文作者研究結果提示，肺不張2周組解除肺不張后2周仍有部分肺組織膨脹不全，這可能與長時間肺不張導致肺泡上皮細胞損傷、氣管壁破壞有關。

肺泡上皮細胞（AEC）包括肺泡Ⅰ型上皮細胞（AECⅠ）和肺泡Ⅱ型上皮細胞（AECⅡ）， 其中AECⅡ是肺泡上皮細胞的原始干細胞，具有重要的生理功能。AECⅡ具有很強的分化、增生能力，在急性肺損傷時可以分化為AECⅠ，在轉化生長因子（TGF）-β1的誘導作用下可以轉化為間充質細胞、成纖維細胞［11］，從而起到增殖、修復肺組織損傷的作用。SPA是由肺泡Ⅱ型細胞分泌的一種脂蛋白，主要成分是二棕櫚酰卵磷脂，分布于肺泡液體分子層的表面，具有廣泛的生理學作用，如： 降低肺泡表面張力、增加肺的順應性、維持大小肺泡容積的相對穩定、防止肺不張及防止肺水腫等。本文結果表明，肺不張后SPA表達下降，此過程在肺不張一周內不明顯，而在兩周時SPA表達下降顯著，肺不張過程中SPA的表達下降可能是肺不張病理生理學的重要改變之一。提示在肺不張發生一周內盡早解除肺不張，有助于疾病預后改善。

基于上述研究，作者認為肺復張后SPA表達隨肺不張時間延長而減少； 肺不張后肺復張CT影像學改善取決于發生肺不張時間，在一周內解除肺不張，肺復張改善良好。本研究存在一定的不足，如未能進一步研究時間超過兩周以上的肺不張。此外，采用實驗方法及檢測指標不夠全面，尚未進一步探討不同時間肺不張分子生物學機制及有效的干預手段，此亦即本研究值得進一步深入的方向。

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Expression of Pulmonary Surfactant-associated Protein A and CT Imaging in Lung Re-expansion Minipig after Atelectasis

TU Jun-wei1， WANG Sai-bin1， SHENG Yi-jun1， CHEN Hui-jun1， TIAN Jiang-hua1，SHENG Lin1， YING Ming-liang2， Hu Bin3， HE Zhong-ping4
（1. Department of Pneumology， 2. Department of Radiology， 3. Department of Pathology，Jinhua Municipal Central Hospital， Jinhua 321000， China； 4. Jinhua Municipal Institute for Food and Drug Control， Jinhua 321000， China）

Objective To investigate the expression of Pulmonary surfactant-associated protein A （SPA） and the CT imaging in lung re-expansion after atelectasis. Methods The minipig model of lung re-expansion after atelectasis was established. Male China Experimental Miniature Pig-I were randomly divided into three-days atelectasis group （3 d）， one-week atelectasis group （1 week） and two-weeks atelectasis group （2 weeks）， respectively （n=6）. Pigs were euthanized after two weeks of lung re-expansion. The expression of SPA of experimental lung tissue was detected by immunohistochemistry. At specified time point， CT value and imaging changes were measured. Results The expression of SPA was lower in 2 weeks group than that in the other two groups （P＜0.01）. The CT value was lower in 3 d group than that in the other two groups （P＜0.01）， and the degree of lung re-expansion was the highest level in 3 d group among three groups. Conclusions The SPA expression of experimental lung tissue was decreased with atelectasis prolonged. The CT imaging indicated that improvement of lung re-expansion was dependent on the time of the atelectasis and the preferable opportunity of atelectasis cure was within one week.

Atelectasis； Re-expansion； Pulmonary surfactant-associated protein A（SPA）； CT value

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0436-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.002

2015-06-15

浙江省科技計劃項目（2012C37090）

涂軍偉（1972-）， 男， 碩士， 主任醫師， 從事呼吸內科專業。E-mail： tujw2008@126.com

王賽斌（1982-）， 男， 碩士， 主治醫師， 從事呼吸內科專業。E-mail： wsaibin@126.com