子癇前期大鼠模型建立及相關指標監測

周　晶， 嚴國鋒， 羅章源， 陳東寶， 陳學進， 李　垚

（1. 上海交通大學醫學院實驗動物科學部， 上海200025；2.復旦大學生命科學學院， 上海200433；3. 杰升生物科技（上海）有限公司， 上海201112）

子癇前期大鼠模型建立及相關指標監測

周晶1，2， 嚴國鋒1， 羅章源3， 陳東寶1， 陳學進1， 李垚1

（1. 上海交通大學醫學院實驗動物科學部， 上海200025；2.復旦大學生命科學學院， 上海200433；3. 杰升生物科技（上海）有限公司， 上海201112）

目的 使用SD大鼠構建子癇前期動物模型，并采用遙測法監測模型大鼠的動脈血壓，分析掌握模型動物在自由活動狀態下的血壓及其他各項生理生化指標。方法 將16只SD大鼠分為4組， 遙測模型組A： 大鼠植入遙測子并構建子癇前期模型。模型組B： 僅構建子癇前期模型。遙測對照組C： 植入遙測子并制作模型假手術。對照組D： 僅制作子癇前期假手術。A、C組在遙測子植入后連續監測血壓數據。各組收集妊娠13.5 d、20.5 d尿液檢測尿總蛋白、尿肌酐。妊娠21.5 d臨產前將母鼠安樂死，取肝、腎、胎盤組織進行HE染色。結果 模型組A制模2 d后平均動脈壓、收縮壓、舒張壓較對照組C顯著上升（P＜0.01），妊娠21.5 d時平均動脈壓、收縮壓、舒張壓較對照組C顯著降低（P＜0.01）。模型組A、B尿總蛋白/肌酐比值顯著高于對照組C、D （P＜0.01），同時A、B兩組肝、腎、胎盤組織結構也出現了改變，并且出現70.49%胎鼠發育停止。結論 成功構建子癇前期大鼠模型，獲得大鼠在自由活動狀態下的動脈壓、尿生化、胎盤胎鼠發育情況，掌握了模型動物在妊娠期真實的、連續的血壓變化周期。該模型或可成為子癇前期疾病研究的理想動物模型。

生理遙測； 子宮胎盤缺血再灌注模型（RUPP）； 子癇前期（PE）； 平均動脈壓（MAP）

子癇前期（preeclampsia， PE） 是一種常見的妊娠期高血壓疾病，臨床癥狀主要表現為無高血壓史的孕婦， 在妊娠中、后期血壓升高，出現蛋白尿， 同時PE極易引起胎盤功能異常、胎兒生長受限［1，2］。目前關于PE的病因及發病機制仍不明確。研究表明，PE的發病原因可能與妊娠早期子宮胎盤動脈局部缺血、缺氧有關，滋養細胞侵蝕子宮螺旋動脈能力發生異常，細胞凋亡、壞死、合體化現象增多［3，4］。通過建立具有子癇前期病癥的動物模型，可以進一步研究其病因及發病機制。

理想的子癇前期動物模型應具有妊娠期特有的高血壓、蛋白尿等臨床病癥［5，6］。本實驗主要采用手術干預的方法以SD妊娠鼠作為實驗對象，通過狹窄腹主動脈（腎動脈以下、髂動脈分叉以上）及雙側子宮動脈（尾端，與第一個胚胎齊平處），減少子宮胎盤血流灌注，造成胎盤局部缺血缺氧、再灌注，通過氧化應激誘導繼發性高血壓，形成子宮胎盤缺血再灌注（reduced uterine perfusion pressure，RUPP）模型，使母鼠能在造模后產生高血壓、蛋白尿等病癥，模擬人子癇前期的臨床癥狀，從而研究子癇前期的發病機制及病因。為了獲得準確可靠的血壓數據，本次實驗采用了生理信號采集分析系統監測妊娠鼠的動脈血壓。該系統通過預先埋入妊娠鼠體內的壓力遙測植入子，實時傳遞、分析并儲存妊娠鼠的收縮壓、舒張壓，獲得妊娠鼠清醒、安靜狀態下的平均動脈壓（MAP），避免了妊娠鼠應激造成的誤差。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物14～16周齡的清潔級SD大鼠，雄雌各16只，上海斯萊克實驗動物有限責任公司［SCXK（滬）2012-0002］提供。

1.1.2主要儀器ADINSTRUMENTS公司的動物生理信號采集分析系統（powerlab16/35）。ThermoFisher公司的全自動生化分析儀（KONELAB20）。LEICA公司的冰凍切片機（CM1900）。Olympus公司顯微鏡（BX53）。杰升生物科技（上海）有限公司血壓遙測系統（Genix2012）。

1.2實驗分組

大鼠飼養于上海交通大學醫學院實驗動物科學部［SYXK（滬）2013-0050］，適應性飼養一周后，按雌雄比1∶1進行合籠，以發現陰栓當日記為妊娠0.5 d。隨機將16只SD雌性大鼠分為4組，每組4只： 遙測模型組A、模型組B、遙測對照組C、對照組D。A、C組埋入壓力信號遙測植入子、監測動脈血壓，臨產前灌注妊娠鼠，取肝、腎、胎盤，進行免疫組織化學檢測。B、D組不含遙測植入子，臨產前用10%水合氯醛過量麻醉對母鼠實施安死術，統計胎鼠數量、體質量。

1.3實驗方法

1.3.1壓力信號遙測植入子埋植取妊娠7.5 d A、C組母鼠，以體積分數4%異氟烷氣體誘導麻醉，1.5%維持，切開大鼠頸部皮膚，鈍性分離大鼠頸動脈，用針尖劃開頸動脈，將遙測植入子導管埋入，植入子系統放置于頸部皮下，縫合創口，并置于37 ℃熱臺復蘇， 術后連續3 d肌肉注射青霉素2 0000 U/kg。分別于妊娠13.5 d、14.5 d、16.5 d、17.5 d、20.5 d、21.5 d上午9∶00～10∶00監測兩組妊娠鼠動脈壓。

1.3.2RUPP模型制作取妊娠14.5 d的A、B組母鼠，以體積分數4%異氟烷氣體誘導麻醉，1.5%維持，沿腹中線切開，鈍性分離腹主動脈，用0.33 mm內徑的U型銀夾套入腹主動脈，U型口朝上。用顯微鑷分離雙側子宮動脈尾端，用0.2 mm內徑的U型銀夾套入子宮動脈。統計雙側子宮內胚胎數后進行縫合。對C、D組母鼠進行假手術，手術步驟同上，僅分離腹主動脈與雙側子宮動脈后直接關腹。

1.3.3尿總蛋白、尿肌酐測定4組母鼠妊娠13.5 d、妊娠20.5 d時， 放置于代謝籠內， 收集尿液， 用Themo公司的生化分析儀檢測尿總蛋白、尿肌酐指標。

1.3.4組織病理學檢測A、C兩組母鼠妊娠21.5 d臨產前，用體積分數10%水合氯醛腹腔麻醉，質量分數4%多聚甲醛（PFA）經心灌注，灌注后取腎、肝、胎盤，置于4%PFA中固定，24 h后用質量分數30%蔗糖溶液脫水，進行冰凍切片、HE染色，在光鏡下觀察其組織形態學改變。

1.3.5胎鼠、胎盤體質量測量B、D兩組母鼠妊娠21.5 d臨產前，用10%水合氯醛過量麻醉，實施安死術，開腹取出子宮，分別稱取胎盤及胎鼠體質量并記錄。

1.4統計學方法

2　結果

2.1動脈血壓

實驗通過壓力信號遙測植入子與生理信號采集儀， 獲取妊娠鼠9∶00～10∶00時動脈壓， 取妊娠鼠安靜狀態時連續測得的1 500個心動周期的動脈壓數據， 每50個周期取一均值， 即每只妊娠鼠每監測日共計30組動脈壓數據， 用SPSS19.0軟件進行分析， 獲得實驗數據。A、C兩組動脈壓數據比較： A組進行RUPP造模手術2 d后， 動脈血壓上升， 但妊娠后期MAP驟然下降。而C組妊娠鼠動脈壓較為穩定， 假手術前后（妊娠14.5 d與16.5 d）的MAP較穩定， 妊娠21.5 d的MAP升高。比較兩組妊娠鼠MAP、收縮壓、舒張壓發現， 妊娠14.5 d時， 兩組動脈壓數據差異無統計學意義（P＞0.05），妊娠16.5 d、17.5 d時，A組MAP、收縮壓、舒張壓均顯著高于C組（P＜0.01）。當妊娠21.5 d時， C組MAP、收縮壓、舒張壓顯著高于A組（P＜0.01）。

2.2尿總蛋白、尿肌酐

尿蛋白是診斷子癇前期的重要指標，本實驗用尿總蛋白/尿肌酐（TP/CREA）的比值測定代替24 h尿蛋白定量［7］，實驗分別收集4組大鼠制模手術前（妊娠13.5 d）及臨產前（妊娠20.5 d）的尿液， 并利用生化分析儀進行分析， 發現模型組A、B妊娠20.5 d的TP/CREA比值顯著高于妊娠13.5 d的比值（P＜0.01），而對照組相應數據無顯著差異（P＞0.05）， TP/CREA的比值增大是初期腎損傷的敏感指標，其比值增大表明模型組出現腎損傷、蛋白尿。

表1　妊娠大鼠動脈血壓 mmHg

表2　妊娠大鼠尿總蛋白、尿肌酐

表3　妊娠大鼠胎鼠、胎盤體質量

2.3胎鼠體質量及胎盤重量

經RUPP造模后，模型組B死胎率為70.49%，為對照組D的14倍，且模型組能正常發育的胎鼠體質量也較對照組顯著降低（P＜0.01）。而兩組胎盤重量差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4組織病理學檢查

對照組C（圖1A）肝小葉結構及肝細胞形態正常，中央靜脈圓形清晰可見， 肝細胞索結構清晰， 細胞大小無異常， 模型組A（圖1B）肝臟結構尚存在， 但中央靜脈變形（△）， 肝細胞索紊亂（↑）。模型組A（圖1D）腎小動脈管壁（↑↑）較對照組C（圖1C）明顯增厚， 管腔狹窄； 腎小球毛細血管內皮增生（※）， 內皮細胞腫脹增大， 腎小管上皮細胞水腫。模型組A胎盤（圖1F）底蛻膜（Decidua， De）較對照組C（圖1E）明顯變薄， 模型組A底蛻膜與海綿滋養層（Spongiotrophoblast， Sp）空泡樣變， 大量纖維蛋白沉淀。迷路帶（Labyrinth， La）滋養葉細胞增生、細胞核碎裂及纖維蛋白沉積，炎性細胞浸潤。

3　討論

子癇前期的病因與發病機制一直是研究熱點與難點，因此對該病迄今尚無有效治療方法，構建理想的子癇前期動物模型無疑為相關研究提供良好基礎。傳統子癇前期動物模型的制作方法主要分為3類： （1）環境刺激法，將妊娠鼠放置于4 ℃環境中反復刺激，激活妊娠鼠體內的腎素-血管緊張素系統，造成妊娠后期實驗鼠血壓的升高［8］。（2）化學藥物干擾法，應用L-精氨酸（L-arginine）抑制一氧化氮合成，從血管內皮水平來反應妊娠高血壓征的病理發生［9，10］。靜脈注射低劑量內毒素，產生PE模型［11］。（3）手術干預法，通過降低子宮胎盤血流灌注量造成妊娠高血壓動物模型［12，13］。

本實驗參考了Ashley 等［12，13］的妊娠期高血壓動物造模方法，通過手術限制妊娠母鼠腹主動脈及雙側子宮動脈的血流量，造成胎盤局部缺血缺氧，從而制作子癇前期的妊娠大鼠模型。經手術RUPP造模實驗后，妊娠大鼠出現收縮壓、舒張壓、平均動脈壓升高，模型組母鼠妊娠16.5 d時MAP即上升到139±15.71 mmHg，這與Javadian等［14］報道的實驗結果無明顯差異。本研究顯示妊娠20.5 d時模型組母鼠動脈血壓下降而對照組上升，原因可能是由于子宮動脈供血不足，模型組妊娠鼠體內70.49%胎鼠死亡，胎盤被吸收，僅少量胎鼠能正常發育，從而子宮動脈供血負擔減輕所造成； 而對照組母鼠隨著體內胎兒發育生長，子宮動脈供血量增多， 血壓適應性增高。模型組妊娠鼠尿總蛋白/肌酐比值增大， 說明妊娠鼠出現蛋白尿。模型組胎鼠正常發育率、體質量降低， 母鼠肝、腎、胎盤組織結構改變，這些均符合子癇前期特有臨床癥狀。

圖1　大鼠肝、腎、胎盤組織病理學觀察

傳統的大鼠血壓測量是尾套加壓法，測量加溫狀態下鼠尾外周即時血壓， 易造成大鼠應激反應，重復性差、容易產生誤差。而利用壓力信號遙測技術（國內已有研究人員將該技術運用于比格犬［15］，但用于小動物的研究報道較少），能在不影響實驗動物自由活動的情況下，長期監測并記錄分析實驗動物的動脈血壓，減少了人為因素引起的外界刺激，從而可獲得較為穩定而持續的動脈血壓，使實驗結果更為精確、可靠。本實驗所用血壓遙測系統通過向模型妊娠鼠頸動脈埋入壓力信號遙測植入子，并配合生理信號記錄儀采集一系列生理數據，監測妊娠鼠在清醒、安靜狀態下的連續動脈血壓。該遙測系統能夠采集到的數據較為真實，并通過實驗動物的自身血壓數據對照減少實驗所需的動物數量，遵循動物實驗的“3 R”原則。

綜上所述，利用壓力信號遙測系統，能實時監測妊娠鼠的動脈血壓，獲得妊娠鼠自由狀態時真實、可靠的血壓數據。采用狹窄妊娠鼠腹主動脈與雙側子宮動脈，可以形成妊娠鼠子宮胎盤缺血再灌注，使妊娠鼠在手術后即出現了高血壓，蛋白尿，胎鼠宮內生長受限等癥狀，是比較理想的子癇前期動物模型構建方式。

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Establishment of Preeclampsia Model in Rat and Detection on Related Indicators

ZHOU Jing1，2， YAN Guo-feng1， LUO Zhang-yuan3， CHEN Dong-bao1， CHEN Xue-jin1， LI Yao1
（1. Department of Laboratory Animal Science； Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 20025， China； 2. School of Life Sciences Fudan University， Shanghai 200433， China；3. Genix Biotek Science Technology Co.Ltd.， Shanghai 201112，China）

Objective To establish preeclampsia SD rat model and monitor the alterations of related indicators in conscious rats. Methods Sixteen SD rats were divided into 4 groups randomly. Telemetrical modeling group A， which was implanted radiotelemetry and built preeclampsia model. Group B was modeling control group， which only built preeclampsia model without radiotelemetry implantation. Group C was implanted radiotelemetry and operated sham-operation of preeclampsia modeling. Group D was only operated sham-operation of preeclampsia modeling. Blood pressure of rats in groups A and C were monitored continuously after radiotelemetry implantation. Urine samples were collected from each group at pregnant day 13.5 and day 20.5 for urine TP and creatinine test. Pregnant rats were euthanieed at day 21.5 of pregnancy， and then the liver， kidney and placenta tissues were collected for HE staining. Results Mean arterial pressure， systolic pressure and diastolic pressure of group A were significant higher than those of group C （P＜0.01） after modeling 2 days， but at the day 21.5 of pregnancy， mean arterial pressure， systolic pressure and diastolic pressure of group A were significantly decreased compared to group C （P＜0.01）. In groups A and B urine TP/creatinine ratio were significantly higher than those of groups C and D（P＜0.01）， also their liver， kidney and placenta tissue structure get pathological changes， and 70.49% fetal growth were ceased in groups A and B. Conclusion Preeclampsia model rats have been established successfully. This rat model will contribute to research of preeclampsia.

Radiotelemetry； Reduced uterine perfusion pressure （RUPP）； Preeclampsia（PE）；Mean arterial pressure（MAP）

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0448-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.004

2015-09-15

周晶（1985-）， 女， 生物工程碩士研究生在讀。E-mail： zj2008@shsmu.edu.cn

李垚（1979-）， 男， 助理研究員。E-mail： yao.li@shsmu.edu.cn