西藏小型豬慢性肺動脈高壓動物模型的建立

劉　蓉， 侯　夢， 廖海星， 張新鳳， 趙　瑾， 劉寶驊，錢元新， 吳清洪， 莫自耀， 廖東江， 李洪濤， 顧為望

（1. 廣州醫科大學附屬第一醫院， 廣州 510120； 2. 廣州醫科大學 呼吸疾病國家重點實驗室，廣州 510230； 3. 南方醫科大學實驗動物中心， 廣州 510515）

·論著·

西藏小型豬慢性肺動脈高壓動物模型的建立

劉蓉1，2， 侯夢1，2， 廖海星1， 張新鳳1， 趙瑾1，2， 劉寶驊1，錢元新1， 吳清洪3， 莫自耀1，2， 廖東江1，2， 李洪濤1，2， 顧為望3

（1. 廣州醫科大學附屬第一醫院， 廣州 510120； 2. 廣州醫科大學 呼吸疾病國家重點實驗室，廣州 510230； 3. 南方醫科大學實驗動物中心， 廣州 510515）

目的 采用野百合堿（MCT）誘導方法建立幼齡西藏小型豬慢性肺動脈高壓（PH）動物模型，并通過右心導管術和肺臟結構形態進行評價。方法 2月齡西藏小型豬12頭， 體質量5.0～6.0 kg。隨機均分為實驗組（MCT組）和對照組，分別腹腔注射給予MCT 12.0 mg/kg和同樣劑量的溶劑（體積分數75%乙醇）； 6周后采用右心導管術測定小型豬肺動脈壓； 觀察小型豬右心肥大指數和肺組織病理改變。結果 與對照組相比，MCT組西藏小型豬平均肺動脈壓顯著增加（24.62±1. 38 mmHg vs 15.10±0.76 mmHg，P＜0.01）。肺組織有明顯血管堵塞、血管腔消失，也可見肺小血管重構，有肺小動脈閉塞、向心性內膜增厚（叢狀血管）的改變。實驗組小型豬右心肥大指數增加明顯（0.36±0.16 vs 0.28±0.13， P＜0.01）。結論 通過腹腔注射MCT 6 周后，可以建立西藏小型豬慢性PH動物模型，其病理特征與人類PH臨床指標相似。

肺動脈高壓（PH）； 野百合堿（MCT）； 西藏小型豬； 右心導管術

肺動脈高壓（pulmonary hypertension， PH）是一種以肺血管阻力進行性升高、最終導致患者右心功能衰竭為特征的惡性肺血管疾病。臨床上肺動脈血壓增高的診斷標準為：在海平面狀態下，靜息時右心導管檢查肺動脈收縮壓＞30 mmHg （1 mmHg= 0.133 kPa） 和 （或）肺動脈平均壓＞25 mmHg，或者運動時肺動脈平均壓＞30 mmHg［1-3］。目前其發病機制還不完全清楚，而動物模型的建立是研究其發病機制的主要途徑［4］。過去使用較多的為大鼠模型，但由于其體型較小、血流動力學特征差別較大； 其他實驗動物如兔［5］、羊［6］和犬［7，8］等模型， 也有相關研究， 但利用超聲心動圖所獲得的PH相關指標有限。為克服這些缺點， 本研究在前期研究基礎上［9］選用幼齡小型豬作為造模對象，觀察模型動物的表現，以期為臨床PH的治療研究建立一個穩定可靠的動物模型。

1　材料與方法

1.1材料

2月齡普通級西藏小型豬12頭，雌雄兼用， 體質量5.0～6.0 kg， 由南方醫科大學實驗動物中心提供［SCXK粵2011-0015］。動物飼養在南方醫科大學實驗動物中心普通級設施不銹鋼籠具中［SYXK（粵）2011-0074］， 房間溫度23～29℃， 相對濕度55%～80%，光照周期12 h/12 h。定期喂食，自由飲水，整個實驗過程符合廣東省實驗動物管理條例的要求。

野百合堿（monocrotaline， MCT）購自成都曼思特生物科技有限公司（HPLC， 99.0%），醫用酒精配成25%注射溶液。肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司）和生理鹽水按比例（0.9%氯化鈉溶液+ 肝素鈉10 U/mL） 混合后， 用注射器吸入一定容量備用。4F心導管（Cordis Corp.， 墨西哥）中充滿肝素生理鹽水， 導引鋼絲也涂上肝素生理鹽水。地西泮注射液（天津金耀氨基酸有限公司）每支10 mg/2 mL，戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）配成3%濃度。

1.2方法

12頭西藏小型豬隨機均分為對照組和實驗組（MCT組）。實驗組腹腔注射MCT 12.0 mg/kg，對照組給予約同樣體積的溶劑（體積分數75%乙醇）； 給藥第3周和第6周采靜脈血取血漿備用。給藥6周后，采用右心導管術測定每頭小型豬肺動脈壓。

小型豬肺動脈壓測定的具體方法： 打開MedLab生物信號采集處理系統（V6.0， 南京美易科技公司），把心導管和換能器連接起來， 接入三通閥和換能器（換能器和插管中充滿肝素生理鹽水， 注意不要有氣泡）。小型豬經麻醉（地西泮注射液6 mg/kg +戊巴比妥鈉溶液10 mg/kg）后仰臥位捆綁在實驗用床上，自由呼吸。通過外科手術暴露右頸內靜脈約20 mm后， 將5F擴張管和外套管（Cordis Corp.， 墨西哥）置入靜脈內， 拔出擴張管，固定外套管。在導引鋼絲幫助下，將導管經外套管送入右頸內靜脈→前腔靜脈→右心房→右心室→肺動脈主干。整個過程均在X光透視條件下進行（Toshiba Medical Systems Corp.，DBX-6000A， 日本），以確保導管端口位于肺動脈主干部位。退出導引鋼絲后， 導管連接定標后的壓力感受器和MedLab， 自動記錄肺動脈收縮壓（sPAP）， 肺動脈舒張壓（dPAP）和平均肺動脈壓（mPAP）。

1.3右心肥大指數測定

于小型豬肺動脈壓測完后，采用注射過量麻醉劑和KCl處死小型豬，取小型豬心臟，稱量右心室和左心室加中隔重量，計算右心肥大指數即右心室/左心室加中隔重量。同時比較右心室重量/體質量、左心室重量/體質量的比值。

1.4肺臟組織病理學檢測

取肺組織固定于質量分數4%的多聚甲醛液中，24 h后經充分水洗，酒精脫水和二甲苯透明后，石蠟包埋，連續切片，切片厚度5 μm。經HE染色后做病理組織形態學檢查。

1.5數據統計方法

2　結果

2.1小型豬肺動脈壓力測定

MedLab生物信號采集處理系統實時記錄了小型豬右心房、右心室和肺動脈壓的壓力波形，保證了肺動脈壓力數據的真實可靠， 如圖1、圖2所示壓力波曲線。與對照組相比，實驗組西藏小型豬給藥6周后的sPAP （33.97±1.66 mmHg vs 22.99± 1.70 mmHg， P＜0.01）、dPAP（19.94±2.46 mmHg vs 11.32 ±1.07 mmHg， P＜0.01）都有顯著增加（表1）。模型組的mPAP與對照組相比也有顯著升高（24.62 ±1.38 mmHg vs 15.10 ±0.76 mmHg， P＜0.01）， 壓力指標達到臨床初級PH的標準。

2.2右心肥大指數

對照組和MCT組小型豬右心肥大指數即右心室與左心室加中隔重量之比，比值有顯著性差異（0.28±0.13 和0.36±0.16， P＜0.05）。說明MCT組的右心肥厚比較明顯， 與肺動脈壓力升高相一致。

圖1　西藏小型豬右心房和右心室壓力波曲線（右心房→右心室）Figure 1 The pressure curve of Tibet minipigs at the right atrium and the right ventricle

圖2　西藏小型豬正常肺動脈壓力波曲線（右心室→肺動脈）Figure 2 Pulmonary artery pressure curve of Tibet minipigs in control group

表1　西藏小型豬給予MCT 6 周后肺動脈壓力變化Table 1 Pulmonary artery pressure of pigs at six weeks after MCT injection mmHg

圖3　各組小型豬肺組織形態學觀察Figure 3 Morphology of pulmonary tissues of the minipigs （HE staining）

2.3病理學改變

MCT組肺小動脈內皮細胞、平滑肌細胞增生肥大， 血管內膜纖維化增厚伴玻璃樣變， 管腔狹窄，閉塞，扭曲變形，呈叢狀改變； 肺小靜脈可見內膜纖維性增生和管腔阻塞（圖3A）； 肺小血管重建，肺小動脈管壁增厚，有肺小動脈閉塞、向心性內膜增厚（叢狀血管）的改變（圖3B）； 肺動脈血管明顯增厚，狹窄， 部分管壁厚薄不均（圖3C）； 支氣管旁的血管（圖3D），左邊動脈血管，管腔狹窄，內皮細胞增生，血管壁明顯增厚，玻璃樣變； 右邊為靜脈管壁，同樣增厚并發生玻璃樣變從而導致管腔狹窄。

3　討論

MCT屬雙稠吡咯啶生物堿，對癌細胞DNA可發生烴化作用而起到抗癌作用，體內注射后主要分布于肝、腎和胃，對多種實驗性腫瘤有抑制作用。在實驗室MCT廣泛用于PH疾病模型的復制，以大鼠使用較多［10］； 近年來兔、羊和犬也都成功地復制了PH動物模型，盡管方法不盡相同，在血流動力學方面與臨床特征均較為接近。但根據病理分析和后續的藥物治療研究顯示，與臨床表現和治療情況反差很大［4］，因此探索建立新的與臨床相近的動物模型顯得非常必要。豬的肺臟血管床結構、呼吸頻率、潮氣量和體型大小等方面與人類極為相似，因此近年來小型豬也常用于PH模型復制和研究［11，12］。但僅限于急性模型的復制，復制方法包括利用低氧［13］或低壓低氧［14］的方法，以及結扎單側肺動脈［11］或經氣管內吸入胎糞法建立急性模型［15］，而且較多使用幼豬（5～10 kg）或新生豬來建立急性PH模型［16］。

陳洪茂等［5］曾開展了利用MCT誘導西藏小型豬建立PH動物模型的研究， 效果較好。但所用的是4～5月齡成年小型豬存在一些缺點， 如實驗后期體型相對偏大，動物固定和操作難度大， 用藥量也大，同時周期偏長（8周）。為克服以上缺點， 考慮到幼齡動物對藥物的敏感性更高，利用2月齡西藏小型豬來建立模型，結果顯示肺動脈壓力波形與臨床變化一致， MCT腹腔注射給藥第6周，肺動脈壓升高明顯， mPAP由15.10 ± 0.76 mmHg 升至24.62 ± 1.38 mmHg， 可以確定6周時間即形成PH， 與之前實驗結果［9］基本一致， 但實驗周期縮短。

右心肥大指數顯示， 小型豬給予MCT（12.0 mg/kg）6周后， 實驗組的右心肥大指數有顯著增加（P＜0.05）。說明右心肥厚比較明顯，與肺動脈壓力升高的結果相一致。實驗組小型豬肺臟結構的病理改變，顯示肺臟重構情況明顯，除了有肺小動脈管腔扭曲變形、狹窄、閉塞以外，也可見到向心性內膜增厚（叢狀血管）的改變； 支氣管旁的血管，不僅動脈血管有管腔狹窄、內皮細胞增生、血管壁明顯增厚，靜脈管壁同樣增厚并發生玻璃樣變從而導致管腔狹窄。從病理改變情況可以認為該模型的病理變化與人類臨床動脈性PH的病理改變一致。同時也驗證了幼齡小型豬正處于生長發育期，對于藥物比較敏感，反應強烈，結構變化比較快，容易出現病理結構的改變。

利用西藏小型豬建立慢性PH動物模型，除指標接近臨床特征外，由于其心肺血管結構與人體高度相似，其血流動力學指標的測定完全可以利用臨床設備進行， 結果也與人體最為接近， 同時作為慢性疾病模型，可以進行長期的觀察和藥物治療研究。總之，通過MCT誘導建立西藏小型豬慢性PH動物模型，方法簡便易行，成功率較高，可以為慢性PH的基礎和臨床研究提供了一個良好平臺。

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Establishment of Chronic Pulmonary Hypertension Model in Tibet Minipig

LIU Rong1，2， HOU Meng1，2， LIAO Hai-xing1， ZHANG Xin-feng1， ZHAO Jin1，2， LIU Bao-hua1， QIAN Yuan-xin1，WU Qing-hong3， MO Zi-yao1，2， LIAO Dong-jiang1，2， LI Hong-tao1，2， GU Wei-wang3
（1. Affiliated First Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510120， China；2. The State Key Laboratory of Respiratory Diseases， Guangzhou Medical University， Guangzhou 510230，China； 3. Laboratory Animal Centre， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China）

Objectives To establish chronic pulmonary hypertension （PH） model with monocrotaline （MCT） in young Tibet minipigs. Methods Twelve Tibet minipigs （weighing 5.0～6.0 kg， aged 2.0 months）were randomly divided into two groups and treated with MCT （12.0 mg/kg） or placebo （75% ethanol）. After six weeks， the pulmonary arterial pressures of the minipigs were measured by performing right heart catheterization （RHC）. The pathologic changes of small pulmonary arteries were observed. Index of right ventricular hypertrophy was also compared between two groups. Results The mean pulmonary arterial pressure by RHC was obviously increased in the MCT group than that in control group （24.62±1.38 mmHg vs 15.10±0.76 mmHg， P＜0.01）. The pathologic observations showed that the pulmonary vascular remodeling and the lumen disappeared in small pulmonary arteries. There was also progressive intimal fibrosis accompany with hyalinization， the lumen was occlusive， twisty and distorted with plexiform lesions. Indexes of right ventricular hypertrophy of MCT group were significantly higher （0.36±0.16 vs 0.28±0.13， P＜0.05）. Conclusions An animal model of chronic PH was established successfully in young minipigs at six weeks after MCT was intraperitoneally injected. The features of the chronic PH model of minipigs are similar with the primary PH parameters.

Pulmonary hypertension； Monocrotaline（MCT）； Tibet minipig； Right heart catheterization

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0431-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.001

2015-06-29

國家973項目（2011CBA01006）； 廣東省科研基礎條件建設項目（2012B060300032）

劉蓉（1976-）， 女， 碩士研究生。E-mail： lrong2007@163.com

李洪濤， 男， 醫學博士， 教授， 研究方向： 呼吸病理生理學。 E-mail： gyhongtao@126.com顧為望， 男， 教授， 博士生導師， 研究方向： 比較醫學。E-mail： Guww100@163.com