一種制備結直腸癌原位移植瘤動物模型的方法

楊喜花， 李耀平， 任連生， 趙莉莉， 楊永明， 閻　磊， 白喜花

（山西醫科大學附屬腫瘤醫院 1. 比較醫學部， 太原　030013； 2. 肛腸科， 太原　030013）

一種制備結直腸癌原位移植瘤動物模型的方法

楊喜花1， 李耀平2， 任連生1， 趙莉莉1， 楊永明1， 閻磊1， 白喜花1

（山西醫科大學附屬腫瘤醫院 1. 比較醫學部， 太原030013； 2. 肛腸科， 太原030013）

目的設計一種制備小鼠腸原位移植瘤模型的新裝置，并用其建立結直腸癌原位移植瘤動物模型。方法制備一種建立小鼠結直腸癌原位移植瘤的裝置，使用該裝置于KM小鼠結直腸原位接種1×106的H22腫瘤細胞，觀察其成瘤情況及腫瘤轉移情況。結果將H22細胞接種于昆明小鼠結直腸部位， 小鼠平均生存時間為16.5±4.5 d。動物死亡后解剖，觀察到6只動物全部形成腫瘤， 成瘤率為100%， 個別動物有骼淋巴結轉移， 轉移率為33.3%。結論采用自制結直腸癌原位接種器可成功建立結直腸癌原位移植瘤動物模型，該方法具有操作簡便，成瘤率高的優點。

結直腸癌； 原位移植瘤； 動物模型

結直腸癌是一種常見的嚴重威脅人類生命健康的惡性消化道腫瘤，發生率僅次于為胃癌和食道癌［1］。近年來結直腸癌的發病率逐年增加，發病人群趨于年輕化， 但總體治愈率沒有得到顯著提高［2-4］。本文采用自制的結直腸癌原位接種裝置建立結直腸癌原位移植瘤動物模型。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

清潔級雄性KM小鼠6只，5～6周齡，山西省腫瘤研究所生產［SCXK（晉）2012-0001］。

動物飼養于清潔級動物屏障環境設施［SYXK（晉）2012-0001］，24～26 ℃，相對濕度40%～60%，12 h/12 h照明。飲用水經高壓115 ℃滅菌，用無菌全價營養飼料（北京科奧協力飼料有限公司生產）喂養。

1.2自制接種器及其使用方法

自制接種器如圖1所示，包括一個擴張固定管1和注射器2，擴張固定管1前端面下部沿其長度方向凸出形成管頭3，擴張固定管1上部沿其長度方向開設有直線形注射孔4，使用時注射器的針頭插入注射孔4，針頭長度大于注射孔4長度，注射孔4的內側端口位于管頭上方的擴張固定管1前端面、外側端口位于擴張固定管1的外端面； 擴張固定管1末端連接一個與擴張固定管具有折彎角的握持部5。注射孔4的直徑為0.45～0.5 mm，長度為8～10 mm。擴張固定管直徑為3～4 mm， 管頭長度為3～4 mm。采用1 mL一次性無菌注射器進行注射。

使用時，先將擴張固定管前端涂潤滑劑，插入小鼠肛門內并固定，將注射器經注射針孔插入將細胞懸液注入結腸壁下，退出針頭，緩緩拔出擴張固定管即可。擴張固定管起到固定直腸的作用。管頭與擴張固定管的結合部位的附近區域形成一個直腸折角，直腸貼緊擴張固定管前端面，使注射器針頭能夠容易內探到直腸。

圖1　自制小鼠結直腸癌原位移植瘤接種器示意圖

1.3細胞株

小鼠肝癌細胞株H22由河北醫科大學實驗動物中心饋贈。復蘇凍存的H22細胞， 接種于KM小鼠的腹腔， 無菌抽取接種后7 d的腹水， 用生理鹽水洗滌1次， 再用生理鹽水調整細胞濃度為1×107/mL。

1.4接種方法

一人固定小鼠使其處于仰臥位，另一人取浸泡于質量分數0.01%新潔爾滅溶液中消毒的自制接種器，頭部蘸小許液體石蠟，從肛門處緩緩插入，插入段全部沒入肛門，注射器抽取細胞懸液100 μL，將注射器針頭全部插入注射孔，緩慢注入細胞懸液，3～5 s后，輕輕旋轉注射器90度，緩慢拔出針頭即可（圖2）。

1.5指標觀察

接種后動物常規飼養管理， 每日觀察動物的活動及采食情況， 如果發現動物有死亡， 及時解剖， 觀察記錄直腸處是否有腫瘤生長。觀察期為30 d， 觀察期結束， 頸椎脫臼處死動物， 解剖觀察動物成瘤情況及淋巴結轉移情況， 統計小鼠的腫瘤生成率及淋巴結轉移率。

2　結果

將1×106的H22細胞接種于KM小鼠結直腸部位，在小鼠肛門處觀察到有黑色糞便結痂或出現稀便現象， 下腹部略隆起； 小鼠生存時間為11～22 d，平均生存時間為16.5±4.5 d。動物死亡后解剖，觀察到6只動物全部形成腫瘤，所成腫瘤全部位于恥骨所形成的環內， 并且向腹腔內生長； 個別動物有骼淋巴結轉移， 轉移率為33.3%。由于腫塊的壓迫，尿液無法排出， 膀胱大多呈充盈狀態（表1、圖3）。

表1　KM小鼠結直腸原位接種H22細胞后的情況

圖2　使用自制接種器進行小鼠的細胞接種

圖3　小鼠成瘤及轉移情況

3　討論

目前在建立腫瘤動物模型時，大多采用皮下腫瘤細胞注射法。無論是肝癌、胃癌、宮頸癌、肺癌等，均將腫瘤細胞接種于小鼠的皮下或肌肉，形成體表或皮下腫瘤。這樣接種形成的腫瘤與臨床常見的自然發生的腫瘤在生長環境和病程進展等方面均有較大的差異。

原位移植能更好地模擬結直腸癌的臨床生物行為［5］，比如腫瘤的局部生長，腫瘤的浸潤，癌細胞原位脫落穿過血管壁進入門靜脈循環血運轉移等過程。建立腫瘤原位移植瘤，以往大多采用手術方法，比如要建立直腸癌動物模型，需要將腹腔打開，將腫瘤細胞擱于腸壁下，實驗操作比較困難， 造成失誤較多，且術后護理工作量大，動物死亡率高， 也難以建立大量的動物模型供實驗使用。

為了解決這一問題， 作者制備了一種用于建立小鼠原位結直腸癌模型的裝置，可方便地應用于原位結直腸癌小鼠模型的建立。在熟練掌握操作技術的前提下，接種成功率可達100%。使用該裝置制備小鼠直腸癌原位移植瘤動物模型具有操作簡便對動物損傷小、成瘤率高、方便實用等優點。結直腸癌原位移植瘤動物模型的建立為結直腸為結直腸癌的防治研究工作提供了方便適用的模型動物。

［1］董廣才. 奧沙利鉑聯合5-FU/CF治療直結腸癌的臨床研究［J］. 中國中醫藥咨詢， 2012， 12（2）:54-55.

［2］Sun D， Yu F， Ma YK， et al. MicroRNA-31 activates the RAS pathway and functions as an oncogenic MicroRNA in hu man colorectal cancer by repressing RAS p21GTPase acti vating protein 1（RASA1）［J］. J Biol Chem， 2013， 288（13）9508-9518.

［3］李慧慧， 宋寶， 王哲海. 結直腸癌miRNA相關基因單核苷酸多態性與預后相關性研究現狀［J］. 中華腫瘤防治雜志2014， 21（1）:77-80.

［4］林志， 趙晶， 辛彥. Bmi-1蛋白在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義［J］. 實用腫瘤學雜志， 2010， 24（2）:101-107.

［5］Céspedes MV， Espina C， García-Cabezas MA， et al. Ortho topic microinjection of human colon cancer cells in nud mice induces tumor foci in all clinically relevant metastati sites［J］. Am J Pathol， 2007， 170:1077-1085.

A Method for Establishing Colorectal Orthotopic Transplantable Cancer in Mice

YANG Xi-hua1， LI Yao-ping2， REN Lian-sheng1， ZHAO Li-li1， YANG Yong-ming1， YAN Lei1， BAI Xi-hua1

（1. Department of Comparative Medicine， 2. Department of Colorectal and Anal Surgery，Shanxi Cancer Hospital， Shanxi Medical University， Taiyuan 030013， China）

ObjectiveTo develop a self-made inoculator for establishing orthotopic transplantable colorectal cancer in mice. Methods An inoculator for establishing orthotopic transplantable colorectal cancer in mice was designed and made. The inoculator was used for inoculating 1×106H22 cells into colorectal site of each KM mice， and the tumor formation and metastasis was observed. ResultOrthotopic transplanted H22 cells to colorectal site of Kunming mice， the tumor formation rate was 100%， the tumor metastasis rate was 33.3%， and the average lifetime of the mice was 16.5±4.5 d. ConclusionThe self-made inoculator could be successfully used for establishingorthotopic transplantable colorectal cancer in mice. The operation was convenient， and the tumor formation rate was high.

Colorectal cancer； Orthotopic transplant； Animal model

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0305-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.009

2015-05-31

山西省實驗動物專項基金課題［2014（K03）］

楊喜花（1980-）， 女， 博士， 主管技師。E-mail: yangxihua@126.com。

李耀平（1966-）， 男， 主任醫師，E-mail: liyaoping1600@sina.com