美洲旱獺感染實驗飼養(yǎng)管理及實驗技術(shù)探討

薛康寧， 李曉燕， 李利利， 張賀源， 盧選成

（1. 中國疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心， 北京 102206；2.中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所， 北京　102206）

美洲旱獺感染實驗飼養(yǎng)管理及實驗技術(shù)探討

薛康寧1， 李曉燕1， 李利利2， 張賀源1， 盧選成1

（1. 中國疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心， 北京 102206；2.中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所， 北京102206）

現(xiàn)代生命科學研究對實驗動物的要求越來越廣泛、嚴格、多樣化［1］， 從用標準化的實驗動物做研究發(fā)展到利用特殊的實驗用動物， 從用已經(jīng)人工馴化的動物發(fā)展到利用野生動物。美洲旱獺（Marmota monax，woodchuck）在感染“美洲旱獺肝炎病毒”（woodchuck hepatitis virus， WHV）后會出現(xiàn)一些與人感染肝炎病毒后非常相似的臨床癥狀， 包括亞臨床癥狀或一過性感染、慢性感染癥狀、以及肝癌， 因此美洲旱獺是評價針對肝炎病毒治療性疫苗的理想模型［2］， 而建立美洲旱獺飼養(yǎng)技術(shù)和實驗技術(shù)并規(guī)范化，是開展所有研究工作的前提和基礎(chǔ)， 本文就美洲旱獺甲型肝炎病毒感染實驗中涉及到的飼養(yǎng)管理及實驗技術(shù)進行探討， 以期為相關(guān)研究提供參照。

1　美洲旱獺飼養(yǎng)管理

1.1美洲旱獺的生物學特性

美洲旱獺，俗稱土撥鼠，屬嚙齒目（Rodentia）松鼠科（Sciuridae）旱獺屬（Marnota）， 是松鼠科動物中體型最大的一種［3］。近年來應(yīng)用旱獺制作人類疾病的動物模型研究越來越多［4，5］。深入了解旱獺的生物學特性，掌握旱獺的飼養(yǎng)管理和實驗技術(shù)，是開展相關(guān)研究的重要保證。

1.1.1生物學特性及相應(yīng)的飼養(yǎng)要求旱獺為穴居動物，洞穴是旱獺冬眠、繁殖、過夜、避敵、休息、玩耍的共用場所［3］。因此在旱獺的飼養(yǎng)過程中需要給旱獺提供一個干燥清潔，光照強度較弱的飼養(yǎng)環(huán)境。旱獺耐饑餓，不飲水，喜歡食入帶有露水的草［3］，因此在旱獺的飼養(yǎng)過程中應(yīng)提供適當?shù)男迈r蔬菜，如圓白菜等，來為旱獺提供必需的水分及纖維素等營養(yǎng)。

1.1.2旱獺飼料要求旱獺為草食性動物， 凡牛、羊、兔采食的飼料均可作為旱獺的飼料［3］。本實驗室對美洲旱獺飼喂由北京市科奧協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的兔生長繁殖飼料， 主要營養(yǎng)成分: 粗蛋白18.93%，粗脂肪3.04%，粗纖維10.52%，水分7.98%。

1.2風險評估

生物風險評估是在ABSL-2實驗室內(nèi)安全開展實驗的重要前提， 是實驗室采取風險控制措施、建立安全管理體系和制定安全操作規(guī)程的依據(jù)［6］。將風險評估的內(nèi)容及時告知實驗人員及工作人員可大大加強生物風險的防控力度， 避免出現(xiàn)實驗室感染事件。

本次感染實驗的病原微生物為甲型肝炎病毒（HAV），按照加拿大公共衛(wèi)生署官方網(wǎng)站提供的病原體安全資料表及風險評估（pathogen safety data sheets and risk assessment）中關(guān)于甲型肝炎病毒的內(nèi)容對本次實驗進行風險評估［7］:

1.2.1病原介紹特性: 甲型肝炎病毒屬于小核糖核酸病毒科， 肝病毒屬，二十面體結(jié)構(gòu)，無囊膜，已鑒定出7種基因型（I～VII）； 致病性: HAV只會引起急性肝炎，與慢性肝炎病毒并無關(guān)系，大多數(shù)被感染者并不表現(xiàn)出特異性臨床癥狀，伴有胃腸道癥狀，病程通常少于2個月，在極少數(shù)情況下，HAV能引起嚴重的癥狀，導(dǎo)致患者死亡。宿主范圍: 人類，黑猩猩以及其他非人靈長類動物例如狨猴、絹毛猴、梟猴、松鼠猴也對HAV易感。感染劑量: 未知。傳播途徑: 通常為糞口傳播，最常報道的HAV感染來源是家庭內(nèi)，或與其他被感染人員的接觸， 其他潛在的感染途徑包括性傳播， 在HAV流行國家旅行，以及非法使用受污染的藥物與針頭，罕見通過食入或飲入受感染的食物或飲水傳播的情況，通過輸血或使用血液制品進行傳播的情況更加罕見。潛伏期: 平均為28～30 d（最短為15 d， 最長為50 d）。傳染性: 在潛伏期的后半段時間傳染性最強，并且在出現(xiàn)黃疸后持續(xù)幾天強的傳染性。不會出現(xiàn)糞便長期排毒的情況。穩(wěn)定性與存活力: 1%次氯酸鈉可滅活甲肝病毒，85℃，1 min即可滅活，病毒離開宿主后在室溫下或酸性條件下極其穩(wěn)定，這樣可以保證病毒在環(huán)境中存活，并且可以通過受污染的食物或飲水來傳播。

1.2.2治療藥物及預(yù)防 還未發(fā)現(xiàn)對甲肝的有效特異性治療，建議臥床休息，均衡營養(yǎng)，避免飲酒及其他損肝毒物； 暴露于HAV病毒的人員應(yīng)在兩周之內(nèi)接受HAV免疫球蛋白注射（0.02 mL/kg體質(zhì)量），對于實驗室工作人員，在暴露之前注射滅活HAV疫苗可有效預(yù)防。

1.2.3實驗室風險實驗室的樣本來源為被感染人員或非人靈長類動物的糞便，其他來源還包括血液，肝組織以及膽汁； 主要危險來源為注射帶有HAV病毒生物樣本（糞便、血液）或者間接接觸被污染環(huán)境的表面。

1.2.4防范措施實驗中的個人防護應(yīng)包括實驗服，手套及護目鏡，所有可能產(chǎn)生氣溶膠、高濃度或大量病毒的操作都應(yīng)在BS48內(nèi)進行，嚴格限制使用利器。

1.2.5實驗廢品處置 所有相關(guān)材料用化學消毒液或蒸汽高壓鍋進行消毒，或者進行焚燒。

1.3動物來源、動物接收及人員的防護

雄性美洲旱獺6只，1～3歲，體質(zhì)量3.0 kg左右，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所實驗動物資源北方中心。

整個動物接收過程需有獸醫(yī)、動物供應(yīng)商及實驗人員三方共同在場確認。動物的接收、大體檢查及傳入等工作需詳細記錄在《動物中心實驗動物接收、檢疫記錄表》中，表的主要內(nèi)容包括實驗名稱、實驗人員聯(lián)系方式，動物接收時間，動物品種、品系及級別，接收動物的數(shù)量、性別、日齡或體質(zhì)量，供應(yīng)商信息、動物運輸方式、運輸條件、動物質(zhì)量合格證的編號、動物運輸包裝的完整性、傳入屏障區(qū)的房間號、房間負責人、傳入屏障區(qū)的方式及傳入人和獸醫(yī)檢查結(jié)果描述等信息。運輸此美洲旱獺的運輸籠具為木制運輸箱箱內(nèi)存放有墊料及飲水，保證動物在運輸過程中的舒適度。接收工作結(jié)束后，獸醫(yī)需對新進動物進行原位檢疫。

根據(jù)風險評估的內(nèi)容，個人防護應(yīng)穿戴實驗服、手套、醫(yī)用口罩、護目鏡，特別是為了防止動物抓傷咬傷，操作人員還需穿戴防咬手套。

1.4屏障設(shè)施內(nèi)籠具飼養(yǎng)

飼養(yǎng)籠具及飼養(yǎng)房間在接收旱獺之前用1∶600濃度稀釋的百毒殺進行噴霧消毒，待籠具干燥方可將旱獺放入。本次實驗中使用的籠具為生物安全負壓實驗犬猴飼養(yǎng)系統(tǒng)籠具（圖1）（美國Rockvill Steel& Manufacturing公司開發(fā)制造，6.0 Bio-Containment Module#1C-A4BC，PLC型）。該型號的負壓抽吸系統(tǒng)，特別用于確保預(yù)設(shè)負壓下的風機變速，確保動物籠內(nèi)負壓大于等于10 Pa，可以防止病原微生物的外泄，保證動物飼養(yǎng)設(shè)施內(nèi)的生物安全。每個籠的大小為15.5立方英尺。籠具配備有鎖式拉門、擠壓板。采取每籠單只飼養(yǎng)模式。

1.5飼料及飼喂頻率

結(jié)合美洲旱獺供應(yīng)方飼養(yǎng)人員的經(jīng)驗，確定每日9∶00、15∶00定時飼喂。分別供給新鮮圓白菜50 g，兔飼料30 g，新鮮花生5 g。

1.6飼養(yǎng)間環(huán)境

飼養(yǎng)間內(nèi)溫度控制在22～26℃，相對濕度控制在40%～60%，光照為睡眠燈與黑暗8 h更換。飼養(yǎng)間的通風頻率穩(wěn)定在15次/h。

圖1　飼養(yǎng)美洲旱獺籠具

2　美洲旱獺實驗操作技術(shù)

2.1動物的抓取和保定

采用籠具保定法，即通過籠具擠壓板縮小旱獺所處的空間，使其身體被固定在擠壓板和籠具正面的狹小空間內(nèi)，使其無法自由活動，以達到保定的效果。無需人工抓取，即可完成后肢肌肉注射麻醉劑的操作。

2.2動物標記

單只飼養(yǎng)，采用籠具插標簽編號法。標簽可置于籠位外表，包含的信息有實驗名稱，動物進駐時間，實驗人員聯(lián)系方式，動物體質(zhì)量，日齡，以及動物編號等。

2.3實驗操作前麻醉方法的確定

參照文獻中推薦的麻醉藥品及麻醉方法，即選用鹽酸氯胺酮進行后肢肌肉注射，達到全身麻醉的效果，按照15 mg/kg、45 mg/kg、99 mg/kg體質(zhì)量計算用藥量，3種注射劑量均有效［8］。本次實驗采用了45 mg/kg 體質(zhì)量的給藥量， 顯效時間為1～3 min，麻醉維持時間為20～40 min，之后美洲旱獺從抑制狀態(tài)逐漸恢復(fù)， 1 h完全恢復(fù)正常狀態(tài)。

2.4給藥途徑與方法

本實驗給藥途徑為后肢內(nèi)側(cè)皮下小隱靜脈注射給藥，一次給藥量為1.0 mL。

2.5血液采集

本實驗根據(jù)實驗人員需要的采血量， 采用5 mL注射器在后肢內(nèi)側(cè)皮下小隱靜脈采集血液，一次可采集2～5 mL。

2.6實驗后護理

實驗操作后，應(yīng)待美洲旱獺完全蘇醒后方可將旱獺送回原籠位，側(cè)身臥位，保證旱獺呼吸通暢，飼養(yǎng)間的溫度保持在22～26 ℃。確保旱獺得到充分休息和足夠營養(yǎng)。獸醫(yī)人員應(yīng)密切關(guān)注動物狀態(tài)，及時進行護理措施。

2.7動物安死術(shù)

本次實驗采用深度麻醉與心臟采血相結(jié)合的方法對美洲旱獺施行安死術(shù)。具體操作為使用鹽酸氯胺酮對美洲旱獺進行麻醉，用藥量為99 mg/kg體質(zhì)量。之后在負壓解剖臺上將旱獺仰臥保定，用注射器在心臟搏動最明顯處進針采血，直至動物心跳呼吸停止為止。由于實驗為甲型肝炎病毒的感染性實驗，動物尸體表面以及排泄物應(yīng)用體積分數(shù)1%次氯酸鈉進行充分噴灑消毒，之后將動物尸體及其他廢棄物分別裝入醫(yī)療垃圾袋中封口，交由相關(guān)人員進行處理。

3　體會

美洲旱獺尚未成為我國的標準實驗動物，與其他實驗動物相比，有其特殊性。飼養(yǎng)過程中的各個環(huán)節(jié)都需經(jīng)過實踐摸索，得到經(jīng)驗。經(jīng)人工馴養(yǎng)的美洲旱獺仍具有野外生存的特性，如兇猛，攻擊性強等，這就需要研究人員在飼養(yǎng)籠具、飲食、實驗技術(shù)操作、人員安全防護等方面不斷探索，以總結(jié)出適合美洲旱獺飼養(yǎng)管理及實驗操作的特定技術(shù)經(jīng)驗。

對于在2級動物飼養(yǎng)設(shè)施內(nèi)開展的感染性實驗，一定要注意風險評估工作的進行。確保參與到感染性實驗的每個人員熟知各項風險因素，將風險程度降至最低。

［1］于海英， 辛淑芳， 王曉寧， 等. 國內(nèi)外實驗動物科學發(fā)展動態(tài)［J］. 中國實驗動物學雜志， 1999， 9（3）:1-4.

［2］Roggendorf M，Yang D， Lu M. The woodchuck: A model for therapeutic vaccination against hepadnaviral infection ［J］. Pathol Biol （Paris）， 2010， 58（4）:308-314.

［3］王山西. 旱獺人工養(yǎng)殖技術(shù)［J］. 農(nóng)村實用技術(shù)， 2006， 4:56-57.

［4］范薇， 王忠東， 陶元清. 青海省野生動物實驗動物化研究進展［J］. 實驗動物科學與管理， 1997， 14（4）:60-63.

［5］李菁菁， 陳乾生. 病毒性肝炎動物模型的研究［J］. 實驗動物科學與管理， 1995， 12（3）:29-32.

［6］薛康寧， 李曉燕， 榮蓉， 等. 動物生物安全二級實驗室實驗活動管理要點探討［J］.實驗動物科學， 2014， 31（5）:42-45.

［7］http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/hepa-eng. php#footnote1［DB/OL］.

［8］范薇. 喜馬拉雅旱獺制動性麻醉方法［J］. 四川動物， 2008，27（6）:1139-1140.

Q95-33

C

1674-5817（2015）04-0320-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.014

2015-05-31

十二五科技重大專項（No.2012ZX10004-404）

薛康寧（1986-）， 女， 研究實習員， 碩士， 從事實驗動物獸醫(yī)工作。E-mail: Xuekn@chinacdc.cn

盧選成（1977-）， 男， 副研究員， 從事實驗動物管理工作。E-mail: luxc@chinacdc.cn