體外受精技術(shù)在大鼠胚胎冷凍保種中的應(yīng)用

周生來(lái)， 王　維， 于　洋， 楊　葳， 張梅英， 鄭志紅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部， 沈陽(yáng)　110001）

體外受精技術(shù)在大鼠胚胎冷凍保種中的應(yīng)用

周生來(lái)， 王維， 于洋， 楊葳， 張梅英， 鄭志紅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部， 沈陽(yáng)110001）

目的探討大鼠體外受精（IVF）技術(shù)在大鼠胚胎冷凍應(yīng)用的可行性。方法選用IVF-20溶液作為大鼠精子獲能和受精培養(yǎng)液，改良大鼠1-細(xì)胞胚胎培養(yǎng)液（mR1ECM） 作為受精卵培養(yǎng)液，對(duì)SD 大鼠進(jìn)行IVF，以輸卵管灌流獲得的2-細(xì)胞胚胎作為對(duì)照，并對(duì)發(fā)育良好的2-細(xì)胞胚胎實(shí)施胚胎冷凍，1周后復(fù)蘇并對(duì)存活胚胎采用輸卵管移植。結(jié)果采用灌流和IVF的方式分別獲得胚胎463枚和588枚， 2-細(xì)胞胚胎301枚（65.01%）和 376枚（63.94%）， 二者受精率相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）； 采用兩種方式獲得的胚胎各凍存150枚， 復(fù)蘇后形態(tài)正常胚胎分別為132枚（88.00%）和130枚（86.66%）， 二者復(fù)蘇率比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）； 對(duì)存活的胚胎各移植5只受體， 分別產(chǎn)仔45只和22只， 二者的產(chǎn)仔率（32.14% vs 16.92%）有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論SD大鼠體外IVF技術(shù)在胚胎冷凍保種中應(yīng)用是可行的， 將為以后基因工程SD大鼠的胚胎冷凍保種提供技術(shù)支持。

大鼠； 超排卵； 體外受精（IVF）； 胚胎冷凍

大鼠是世界公認(rèn)的非常重要的人類(lèi)疾病動(dòng)物模型之一， 在很多方面更優(yōu)于小鼠， 而被廣泛應(yīng)用［1］。特別是近年來(lái)，鋅酯酶、TALENs、CRISP-Cas等生物技術(shù)的快速發(fā)展和成功應(yīng)用，使得基因工程大鼠的品系數(shù)和需求量呈逐年上升趨勢(shì)［2-5］。大鼠胚胎冷凍技術(shù)最早可追溯到1975年， 由Whittingham等首次對(duì)大鼠胚胎進(jìn)行冷凍并獲得成功［6］。隨后，Rall等建立了玻璃化冷凍法， 成為該技術(shù)發(fā)展的又一突破［7］。現(xiàn)已證實(shí)，玻璃化冷凍法是一種快速、簡(jiǎn)捷、可靠的保種方法，可以凍存包括小鼠、大鼠在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物［8-10］。大鼠體外受精技術(shù)最早可以追溯到40年前，由日本Toyoda等研制出適合于大鼠精子體外獲能的培養(yǎng)液，由此逐步形成大鼠體外受精技術(shù)［11］。

雖然兩項(xiàng)技術(shù)起步較早，但兩項(xiàng)技術(shù)的結(jié)合報(bào)道較少［12］，大鼠胚胎冷凍選用的胚胎來(lái)源主要為體內(nèi)胚胎。本研究旨在利用大鼠體外受精（IVF）技術(shù)，結(jié)合胚胎復(fù)蘇、胚胎移植技術(shù)，探討IVF技術(shù)在大鼠胚胎冷凍保種中應(yīng)用的可行性，為今后開(kāi)展基因工程SD大鼠的保種傳代提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3周齡SPF級(jí)供體和12～20周齡受體SD大鼠來(lái)源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（京）2012-0001］。所有實(shí)驗(yàn)用SD大鼠均在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)和繁殖，溫度控制在22±3 ℃，自動(dòng)光控（L∶D=12 h∶12 h， 光照時(shí)間為7∶00-19∶00）［SYXK（遼）2013-0007］。

1.2試劑及儀器

孕馬血清促性腺激素（PMSG） 為寧波市激素制品廠產(chǎn)品； 人絨毛膜促性腺激素（hCG）為上海生物化學(xué)制藥廠產(chǎn)品； 礦物油和透明脂酸酶均為Sigma公司產(chǎn)品； IVF-20培養(yǎng)液、改良大鼠1-細(xì)胞胚胎培養(yǎng)液（mR1ECM）、DAP213凍存液、1 mol/L二甲基亞砜（DMSO）、0.25 mol/L 蔗糖由本實(shí)驗(yàn)室配制。NUNC凍存管產(chǎn)自北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自賀利斯公司。

1.3IVF

按照文獻(xiàn)介紹的方法進(jìn)行IVF［13-15］。

1.3.1精子的采集與獲能將雄鼠用頸椎脫臼處死后無(wú)菌取出附睪尾，并用眼科剪小心剝離附睪尾周?chē)闹荆?在滅菌濾紙上去除血跡和脂肪， 挑出精子滴放于預(yù)先平衡過(guò)夜的IVF-20受精液滴中（精子濃度0.5×107精子/mL）。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 min后， 然后取30 μL精子懸液， 移入另一新鮮液滴， 使精子濃度達(dá)1.0×106精子/mL， 繼續(xù)獲能培養(yǎng)4～6 h。

1.3.2雌鼠的超數(shù)排卵取4周齡SD雌鼠腹腔注射PMSG 25 IU/只，注射52 h后同樣方法注射hCG進(jìn)行超數(shù)排卵。

1.3.3卵子的采集與受精注射hCG 15 h后， 將雌鼠用頸椎脫臼法處死后無(wú)菌取出輸卵管置于IVF-20液滴培養(yǎng)皿的礦物油內(nèi)，在顯微鏡下劃破輸卵管膨大部，收集卵團(tuán)于含有精子懸液的IVF-20液滴內(nèi)，每400 μl液滴中含40～60個(gè)卵母細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)共同孵育12 h。

1.3.4受精結(jié)果的檢查受精培養(yǎng)10 h后將卵子移出，置于含體積分?jǐn)?shù)0.1%透明質(zhì)酸酶的mR1ECM中，用移液器小心反復(fù)吹打以去除卵丘細(xì)胞，然后用mR1ECM 再洗 5～6 遍，最后移入預(yù)先過(guò)夜平衡的mR1ECM 中培養(yǎng)。

1.3.5胚胎的體外培養(yǎng)挑選卵裂球均勻，形態(tài)良好的2-細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)入預(yù)平衡的 mR1ECM 中繼續(xù)培養(yǎng)，待凍存。

1.4體內(nèi)2-細(xì)胞胚胎獲取

在hCG注射 42 h后取見(jiàn)栓雌鼠輸卵管，將輸卵管放入100 μL M2培養(yǎng)液，在實(shí)體解剖鏡下實(shí)施輸卵管灌流，用灌流針插入輸卵管傘部，推動(dòng)注射器栓，沖洗輸卵管2～3次，2-細(xì)胞胚胎將迅速沉至培養(yǎng)皿底部，用吸卵管吸取2-細(xì)胞胚胎在M2洗3次，再放入mR1ECM培養(yǎng)液中，放入體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待凍存。

1.5胚胎的冷凍及復(fù)蘇

按照文獻(xiàn)［16］介紹的方法進(jìn)行胚胎冷凍及復(fù)蘇。

1.5.1凍存液的準(zhǔn)備1 mol/L DMSO于室溫在35 mm培養(yǎng)皿中分成4滴（100 μL/滴）； DAP213及標(biāo)記好的1 mL凍存管（NUNC）在0℃預(yù)冷，待用。

1.5.2胚胎冷凍程序?qū)?-細(xì)胞胚胎放入1 mol/L DMSO液滴中， 洗1次后移入新的DMSO液滴中， 待胚胎沉至培養(yǎng)皿底部時(shí)，用20 μL移液器吸取5 μL 含2-細(xì)胞胚胎的DMSO移至0 ℃預(yù)冷的凍存管管底0 ℃放置1 min， 1 min 后加入預(yù)冷的DAP213凍存液45 μL， 0 ℃再次放置1 min后直接放入液氮。

1.5.3胚胎的復(fù)蘇將凍存管從液氮中取出， 室溫靜置約30～60 s， 加入已37 ℃預(yù)熱的0.9 mL 0.25 mol/L蔗糖溶液，用移液器反復(fù)吹打10～15次后將溶液吸出移入35 mm培養(yǎng)皿中，室溫靜置5 min后，觀察記錄結(jié)果，將狀態(tài)良好的胚胎移入mR1ECM培養(yǎng)液中，洗2次后放置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待移植

1.6胚胎移植

1.6.1假孕鼠的制備取10～20周齡的雌性SD大鼠在移植前1日下午與結(jié)扎雄性大鼠交配，次日見(jiàn)陰栓為假孕0.5 d的大鼠。

1.6.22-細(xì)胞胚胎的移植稱(chēng)重假孕鼠， 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥納（0.45 mL/100 g）腹腔注射將其麻醉，通過(guò)手術(shù)操作引出卵巢、輸卵管、子宮，調(diào)整位置，看清輸卵管走向，在靠近傘口部位下方進(jìn)行剪口，將移卵管插入輸卵管2～3 mm，將胚胎吹進(jìn)壺腹部，略停片刻再拔出。將卵巢、輸卵管、子宮復(fù)位，最后縫合創(chuàng)口。精心飼養(yǎng)，記錄產(chǎn)仔日期、性別、產(chǎn)仔數(shù)量及存活數(shù)等。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　SD 大鼠體外受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1　受精后發(fā)育2-細(xì)胞大鼠胚胎

表2　SD大鼠胚胎冷凍結(jié)果

2　結(jié)果

2.1體外受精

采用輸卵管灌流和體外受精的方式分別獲得卵子463枚和588枚，2-細(xì)胞胚胎301枚和 376枚（表1、圖1），受精率分別為65.01%和63.94%，兩者在受精率相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.2胚胎冷凍結(jié)果

采用兩種方式獲得的胚胎各凍存150枚，復(fù)蘇后形態(tài)正常胚胎分別為132枚（88.00%）和130枚（86.66%），兩者在復(fù)蘇率相比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）； 對(duì)存活的胚胎各移植5只受體， 產(chǎn)仔數(shù)分別為45只（32.14%）和22只（16.92%）（P＜0.05）（表2）。

3　討論

相對(duì)小鼠而言，大鼠在生理、行為、代謝等方面更接近人類(lèi)。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展和成功應(yīng)用，基因工程大鼠的研究成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)的熱點(diǎn)。如何保存好這些珍貴的模型資源至關(guān)重要，胚胎冷凍不失為一種有效的保存方式，既可以降低傳統(tǒng)活體保種帶來(lái)的經(jīng)擠壓力，又可以避免遺傳突變與漂變。

與小鼠相比，大鼠胚胎冷凍的胚胎來(lái)源主要是體內(nèi)胚胎，這樣需要繁育大量的適齡的雄性基因工程大鼠而且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，浪費(fèi)巨大的人力和物力。由于大鼠IVF體系不夠完善，國(guó)際上罕有關(guān)于IVF來(lái)源胚胎的胚胎冷凍報(bào)道［12］。近年來(lái)， 研究者在精子獲能液、 胚胎培養(yǎng)液及提高體外受精胚胎質(zhì)量方面做了大量研究，目的是盡量模擬體內(nèi)受精和胚胎發(fā)育環(huán)境， 探索大鼠IVF的最適條件，以提高其胚胎體外生產(chǎn)效率［13，14，17-19］。

本實(shí)驗(yàn)室在參考文獻(xiàn)［13，14］的基礎(chǔ)上， 選用IVF-20作為精子獲能液，mR1ECM作為受精卵培養(yǎng)液，率先嘗試IVF結(jié)合胚胎冷凍的方式凍存大鼠胚胎，目的是縮短實(shí)驗(yàn)周期、減少飼養(yǎng)成本、節(jié)省人力、物力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用輸卵管灌流和IVF的方式受精率分別為65.01%和63.94%，兩者在受精率相比無(wú)顯著性差異，說(shuō)明IVF的方式可以達(dá)到與體內(nèi)一致的受精結(jié)果， 體外培養(yǎng)結(jié)果顯示可以發(fā)育至囊胚； 采用兩種方式獲得的胚胎凍存復(fù)蘇后復(fù)蘇率分別為88.00%和86.66%（P＜0.05），對(duì)存活的胚胎各移植5只受體， 產(chǎn)仔分別為45只和22只， 產(chǎn)仔率（32.14% vs 16.92%）兩者相較差異顯著（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體外受精來(lái)源的2-細(xì)胞胚胎經(jīng)冷凍復(fù)蘇后與體內(nèi)相比發(fā)育潛能受限，但可以得到健康的后代，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以接受。如何優(yōu)化IVF胚胎的質(zhì)量及減少胚胎的冷凍損傷提高產(chǎn)仔率，需進(jìn)一步研究［20］。

綜上所訴，IVF技術(shù)應(yīng)用在SD大鼠胚胎冷凍保種中是可行的，為以后基因工程SD大鼠的胚胎冷凍保種提供技術(shù)支持。

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Application of In Vitro Fertilization in Rat Embryos Cryopreservation

ZHOU Sheng-lai， WANG Wei， YUYang， YANG Wei， ZHANG Mei-ying， ZHENG Zhi-hong
（ Laboratory Animal Center， China Medical University， Shenyang 110001， China）

ObjectiveTo investigate the feasibility of in vitro fertilization （IVF） technique in rat embryos cryopreservation. MethodsIVF-20 was used as rat sperm capacitation and fertilization medium， mR1ECMas a culture solution for IVF fertilized egg of SD rats； 2-cell embryo were obtained by flushing as a control， and well-developed 2- embryos were cryopreserved， after a week the thawed embryos were transplanted to recipients of same strain rats. ResultsA total of 463 and 588 embryos were separately collected from IVF group and control group， the development rate of normal 2-cell embryos was 65.01% （301/463） and 63.94% （376/588） respectively， which showed no significant difference in the fertilization rate （P＞0.05）. In the 150 embryos in each group， morphologically normal embryos were 132 （88.00%） and 130 （86.66%） after the recovery， there was no significant difference （P＞0.05）； Surviving embryos were transplanted into five recipients of same strain rat， and newborn were 45 and 22. The litter rate （2.14% vs16.92%） showeda significant difference between the two groups （P＜0.05）. ConclusionIVF technology of rat is feasible in the embryo cryopreservation and breed preservation. It provides technical supports for cryopreservation of geneticmanipulated rats in future.

Rat； Superovulation； In vitro fertilization（IVF）； Embryo cryopreservation

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0298-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.007

2015-05-31

遼寧省科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（2011408004）

周生來(lái)（1982-）， 男， 講師， 主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究。E-mail: zhoushenglai@163.com

鄭志紅。E-mail: zhihongzheng@163.com