應用Dicer1轉基因小鼠建立黑色素瘤模型的研究

李兆陽， 姜　川， 郭曉沖， 楊　葳， 董婉維， 鄭志紅

（中國醫科大學實驗動物部 遼寧省轉基因研究重點實驗室， 沈陽　110001）

應用Dicer1轉基因小鼠建立黑色素瘤模型的研究

李兆陽， 姜川， 郭曉沖， 楊葳， 董婉維， 鄭志紅

（中國醫科大學實驗動物部 遼寧省轉基因研究重點實驗室， 沈陽110001）

目的應用Dicer1（編碼蛋白屬于RNA酶III家族）轉基因小鼠建立黑色素瘤模型。方法將小鼠黑色素瘤細胞株分別移植于Dicer1轉基因鼠和C57BL/6J小鼠前肢腋下，觀察兩種小鼠的荷瘤情況，包括移植瘤生長情況、移植瘤生長曲線。結果與C57BL/6J小鼠組腫瘤比較，Dicer1轉基因小鼠組的腫瘤成瘤時間短、腫瘤生長速度快、腫瘤體積大（P＜0.05）。結論應用Dicer1轉基因小鼠建立了黑色素瘤模型，結果顯示Dicer1基因對黑色素瘤荷瘤有明顯影響。

Dicer1； 轉基因小鼠； 黑色素瘤

黑色素瘤是皮膚癌中最具侵襲性的惡性腫瘤［1］。近年來， 世界范圍黑色素瘤的發病率以每年3.1%的速度急劇上升［2］。我國黑色素瘤病例增長加快， 每年新發病例約2萬例［3］。目前， 原位黑色素瘤術后5年生存率超過95%， 但是一旦發生轉移， 則很難治愈， 而且預后極差， 5年生存率不到10%［4，5］。B16小鼠黑色素瘤細胞株是生長在C57BL/6J小鼠的自發性腫瘤， C57BL/6J小鼠是研究B16移植瘤和轉移瘤最常用實驗模型之一。腫瘤模型對研究腫瘤的病因、發病機制、抗癌藥物篩選及腫瘤防治等具有非常重要的意義。目前有研究［6-8］報道了Dicer1與黑色素瘤細胞增殖和侵襲能力的相關性， 本研究以Dicer1轉基因小鼠為實驗材料， 建立新的黑色素瘤模型， 為進一步探討黑色素瘤的發病機制提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料

實驗動物: 5～6周齡SPF級雌性C57BL/6J小鼠，來自中國醫科大學實驗動物部［SCXK（遼）2013-0001］，8～10周齡SPF級雌性Dicer1轉基因小鼠， 來自中國醫科大學實驗動物部。試劑: DMEM、青霉素、鏈霉素、PBS均購自Gibco公司。細胞株: 小鼠黑色素瘤細胞 B16F0（實驗室保存）， 小鼠黑色素瘤細胞B16F10（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）。

1.2細胞培養

小鼠黑色素瘤細胞系B16F0、B16F10分別使用含體積分數10 %胎牛血清的DMEM培養基，加入100 IU/mL青霉素、100 IU /mL鏈霉素，37 ℃、體積分數5% CO2恒溫孵箱中培養。使用質量分數0.25%的胰蛋白酶消化并中止后傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3動物實驗

Dicer1轉基因小鼠和C57BL/6J小鼠飼養于SPF環境， 24 ℃恒溫， 光控（12 h明/12 h暗）， 自由攝入水食［SYXK（遼）2013-0007］。Dicer1轉基因小鼠隨機分成2組，每組4只: Dicer1組1（皮下注射B16F0細胞）、Dicer1組2（皮下注射B16F10細胞）； C57BL/ 6J小鼠隨機分成2組，每組4只: C57BL/6J組1（皮下注射B16F0細胞）、C57BL/6J組2（皮下注射B16F10細胞）。

1.4成瘤情況觀察

腫瘤細胞腋下皮下注射后，每日觀察注射部位，出現可觸及的腫塊時記為腫瘤出現時間，每日測量腫瘤最長徑（L）和垂直方向最大橫徑（W），計算腫瘤體積: V=LW2/2； 腫瘤生長速度以腫瘤每天增長的體積計算。待小鼠狀態變差，處死小鼠， 取材。

1.5病理學觀察

移植瘤用體積分數10%中性甲醛固定，HE染色，光學顯微鏡觀察。

1.6統計分析

采用SPSS 11.0軟件進行統計分析，組間比較用方差分析， 成瘤時間、腫瘤生長速度與荷瘤時間用數據以均數±標準差（±s）的形式表示， P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組小鼠腫瘤出現時間

與C57BL/6J組1比較，Dicer1組1的腫瘤出現時間較早（P＜0.05）。與C57BL/6J組2比較，Dicer1組2的腫瘤出現時間較早（P＜0.05）（表1）。

表1　各組小鼠腫瘤結節形成時間

2.2各組小鼠黑色素瘤生長情況

B16F0黑色素瘤細胞在Dicer1轉基因小鼠和C57BL/6J小鼠皮下100%成瘤（圖1）。

B16F0黑色素瘤細胞在Dicer1轉基因小鼠和C57BL/6J小鼠荷瘤生長曲線，結果可見圖2，與C57BL/6小鼠組相比，Dicer1轉基因小鼠組腫瘤生長速度較快。

圖1　B16F0黑色素瘤細胞Dicer1轉基因小鼠和C57BL/6J小鼠荷瘤情況

B16F10黑色素瘤細胞在Dicer1轉基因小鼠皮下100%成瘤， 在C57BL/6J小鼠皮下2只成瘤， 1只未成瘤（圖3，圖4）

B16F10黑色素瘤細胞在Dicer1轉基因小鼠和C57BL/6J小鼠荷瘤生長曲線，結果可見，與C57BL/6小鼠組相比，Dicer1轉基因小鼠組腫瘤生長速度較快。

2.3病理學觀察

圖2　B16F0細胞腫瘤生長曲線

圖3　B16F10黑色素瘤細胞Dicer1轉基因小鼠和C57BL/6J小鼠荷瘤情況

圖4　B16F10細胞腫瘤生長曲線

與C57BL/6J組1相比（圖5B），Dicer1組1（圖5A）血管豐富，核大，深染，可見少量黃色顆粒。觀察C57BL/6J組2（圖5D）和Dicer1組2（圖5C）可見，腫瘤細胞呈巢狀或條索狀排列，腫瘤細胞呈圓形、橢圓形或不規則形，細胞分化差，核質比大，多見核分裂相，可見大黃色顆粒。

3　討論

小鼠黑色素瘤細胞系B16自發產生于美國杰克遜實驗室C57BL/6J小鼠的耳部皮膚，由Fidler等進行實驗動物移植，并培育成可傳代培養細胞系，其起源細胞系稱為F0，F10是第10代接種動物體內后的肺轉移所培育出來的細胞系［9，10］。目前，小鼠黑色素瘤細胞系已廣泛用于腫瘤發生、轉移和影響腫瘤發展、轉移的免疫學研究［11］。黑色素瘤成因比較復雜， 有研究表明，miRNA與黑色素瘤具有相關性［12］。在黑色素腫瘤中，一些miRNA的表達異常［13-16］。Dicer1是一種核糖核酸內切酶，屬于RNaseⅢ家族成員， 是miRNA生物學通路中的核心酶， 它能夠將前體miRNA 切割為成熟的miRNA［17］。在黑色素細胞中， Dicer1通過MITF-Dicer1-（pre-mir-17-92簇）-BIM 通路參與黑色素細胞存活的動態調控［16］。有研究報道，與正常皮膚或者良性痣相比，黑色素瘤中的Dicer1高表達［7，8］，提示Dicer1在黑色素瘤發生、發展過程中發揮著重要的作用。

圖5　B16黑色素瘤組織病理學觀察（HE×100）

本研究使用B16F0、B16F10兩種小鼠黑色素瘤細胞，分別應用Dicer1轉基因小鼠和C57BL/6J小鼠皮下進行荷瘤實驗，觀察腫瘤發生和生長情況，分析了Dicer1轉基因小鼠和C57BL/6J小鼠荷瘤情況。實驗結果表明，兩種B16黑色素瘤在Dicer1轉基因小鼠皮下腫瘤出現時間早，而且增長速度快，這表明Dicer1轉基因小鼠比C57BL/6J更加易感黑色素瘤， 且會加速黑色素瘤的生長， 提示Dicer1基因與黑色素瘤的發生正相關， 這表明Dicer1基因在小鼠黑色素瘤的形成、生長的過程中發揮重要的作用。本研究成功的應用Dicer1轉基因小鼠建立黑色素瘤模型， 為進一步研究Dicer1在黑色素瘤發生、發展中的分子生物學機制奠定了基礎。

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Modeling of B16 Melanoma in Dicer1 Transgenic Mice

LI Zhao-yang， JIANG Chuan， GUO Xiao-chong， YANG Wei， DONG Wan-wei， ZHENG Zhi-hong
（The Key Lab of Laboratory Transgenic Animal of Liao Ning Province， Department of Laboratory Animal Science， China Medical University， Shenyang， 110001， China）

ObjectiveTo establish a model of B16 melanoma model in Dicer1 transgenic mice.

Dicer1； Transgenic mice； Melanoma；

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0294-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.006

2015-05-31

遼寧省科技計劃項目（2010232006）

李兆陽（1982-）， 男， 講師。E-mail: 383777661@qq.com

鄭志紅， 教授。E-mail: zhihongzheng@163.com

MethodsB16 melanoma cell were subcutaneously implanted into Dicer1 transgenic and C57BL/6J mice， the morphology and growth velocity of the tumor were observed. ResultCompared with the contrast group， the tumor formation time in Dicer1 transgenic mice is shorter， the tumor growth rate is faster， the tumor volume is bigger （P＜0.05）. ConclusionThe model of B16 melanoma model was successfully established in transgenic mice and the Dicer1 had significant effects on B16 melanoma bearing of mice.