磁小體介導制備轉基因豬模型

陳克研， 陳振文， 董婉維， 鄭志紅

（1. 中國醫科大學實驗動物部， 沈陽　110032； 2. 首都醫科大學基礎醫學院實驗動物學系， 北京　100069）

磁小體介導制備轉基因豬模型

陳克研1， 陳振文2， 董婉維1， 鄭志紅1

（1. 中國醫科大學實驗動物部， 沈陽110032； 2. 首都醫科大學基礎醫學院實驗動物學系， 北京100069）

目的以磁小體（BMP）和聚乙烯亞胺（PEI）為載體，通過睪丸注射精子介導法建立轉基因豬模型。方法將實驗室保存的脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PLA2）綠色熒光蛋白（GFP）質粒與BMP和PEI混勻，制備BMP-PEI- PLA2-GFP混合物，采用睪丸多點注射法接種巴馬小型豬， 于接種后第2周、4周、6周至第20周采集精液，分別用RT-PCR和免疫熒光鑒定外源基因的表達情況； 取陽性精液，對母豬實施人工授精； PCR及RT-PCR對所產仔豬進行鑒定。結果精液中GFP基因于接種后第4周首現并持續至第16周； 熒光顯微鏡檢查可觀察到GFP蛋白主要表達于精子頂體后區及精子尾頸部； 經人工授精所產21頭仔豬中，9頭豬用PCR可檢測GFP片段，用RT-PCR檢測PLA2表達，該9頭豬的表達量明顯高于其它豬，總陽性率達42.86%。結論BMP和PEI結合可作為良好的攜帶外源基因的非病毒性載體，用該載體通過精子介導法可以達到迅速制備轉基因豬的目的，其成本低、方法簡單、便捷。

豬； 轉基因； 磁小體（BMP）； 聚乙烯亞胺（PEI）； 精子介導的基因轉移

隨著生命科學研究和生物醫藥產業的迅猛發展， 人們對實驗動物模型的要求越來越高， 對轉基因動物的使用也逐漸增多， 轉基因動物已成為醫學科技工作者認識疑難和重要疾病發生機制、深入研究疾病的診斷和藥物開發不可或缺的實驗手段和材料［1］。目前， 常用的轉基因動物制作方法有原核顯微注射法、逆轉錄病毒侵染法、精子介導法、胚胎干細胞法，體細胞核移植法等［2］。高效的轉基因載體是基因釋放系統的核心，在轉基因動物制作過程中至關重要，而一些載體具有細胞毒性，且很多載體對轉基因質粒的攜帶能力有限，載體的缺陷制約了轉基因的穩定性。

非病毒性載體是轉基因動物制備方法的探索方向， 具有低免疫原性和易制備等特性。多聚乙烯亞胺（polyethylenimine， PEI）是近年來研究最為廣泛的陽離子多聚物非病毒基因載體［3］， 是一種很好的基因遞送系統， 可減少PEI/DNA復合物在吞噬泡內富集并進而被降解的作用， 因而可以提高轉染效率。磁小體（bacteria magnetic particles， BMP）是趨磁細菌細胞內合成的磁性納米顆粒， 具有超強吸附DNA的能力， 可用于基因的轉移、檢測及靶向基因治療［4］。研究表明， 將PEI與BMP結合后， 通過外加磁場進行靶向基因導入， 可有效提高轉染效率和基因表達水平。本研究擬利用BMP的趨磁性和較強的吸附DNA能力， 結合PEI 轉染效率高且不易降解等特點， 制備綠色熒光蛋白（GFP）標記的BMP-PEI-GFP復合物； 建立精子介導睪丸注射法接種巴馬小型豬， 而后每隔1周采集精液進行檢測， 觀察其轉染時間、轉染效率及轉染位置； 進一步用陽性精子對發情母豬實施人工授精進行體內實驗； 對所產仔豬是否有外源基因表達進行鑒定，從而建立以磁小體為介質制作轉基因豬的新方法。

1　材料與方法

1.1實驗動物

巴馬小型豬10頭， 其中8月齡公豬6頭， 10月齡母豬4頭，購自北京實創世紀小型豬養殖基地［SCXK（京）2013-0008］，在北京實創世紀小型豬養殖基地的普通級設施實驗［SYXK（京）2013-0029］。

1.2質粒的提取與鑒定

經人工改造過的脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PLA2）-GFP載體，由首都醫科大學實驗動物學系惠贈； 將其接種LB培養基擴大培養，用Axygen質粒大量提取試劑盒提取菌液質粒； 以延伸因子1α（EFlα）啟動子F3做上游引物，Lp-PLA R1做下游引物，對上述提取的質粒DNA進行PCR鑒定； 此外，將該質粒轉染293T細胞做進一步鑒定。

1.3BMP-PEI-PLA2-GFP復合物的制備

取1 μg PEI與1 μg GFP充分混勻， 再取0.5 μg BMP在超聲振動儀中短暫混勻10～20 s； 迅速放置冰上，防止管內液體蒸發，如此反復幾次直至BMP充分分散混勻后，加入預混的PEI-GFP溶液，并再次在超聲振動儀中短暫混勻，加入PBS緩沖液稀釋，4℃保存備用。

1.4睪丸注射法接種轉基因復合物

取6頭生長良好、采精容易、達到性成熟的雄性巴馬小型豬，固定于解剖臺上，耳緣靜脈穿刺，靜脈注射異丙酚（3.0 mg/kg）行誘導麻醉，待豬睫毛反射消失、肌張力下降，進行氣管插管而后按5.0 mg/kg靜脈泵注異丙酚維持麻醉； 睪丸整體依次用碘酊和體積分數75%酒精消毒（圖1A），選取2～4個注射點（盡量選取成平行走向的曲細精管并確定注射點）， 將1 mL BMP-PEI-LpPLA2-GFP轉基因復合物注入（圖1B、C）， 對側做同樣處理； 將磁鐵緊貼注射有質粒的睪丸外壁放置10 min（圖1D）

1.5術后公豬精液檢測

1.5.1基因組PCR檢測每周以手握法采集巴馬小型豬精液，將精液收集于集精杯中，并置于30～35 ℃保溫水浴桶中； 用精子洗滌液離心洗滌2次每次5 min， 盡量除去含DNAase的精漿； 用基因組提取試劑盒提取精液中的DNA，根據GFP基因序列設計引物，配制PCR反應體系，進行PCR擴增上游引物（F）: 5'-TGACCCTGAAGTTCATCT GCACCA-3'， 下游引物（R）: 5'-TTGATGCCGTTC TGC TTGTCG-3'。

圖1　睪丸注射Figure 1　Intratestis　injection

1.5.2精子的熒光顯微鏡檢查 取充分混勻的精子10 μL滴于干凈的載玻片，蓋上蓋玻片； 于熒光顯微鏡下觀察并計數同一視野中在激發熒光和長明光下觀察到的精子，計算二者比率，同時記錄出現綠色熒光的時間及強弱。

1.6人工授精

將保存的精液移至15～20 ℃的操作間，將集精杯迅速置于30～35 ℃的溫水中，并立即評定精液品質，評定包括數量、氣味、顏色、精子形態、密度、活力六項指標；將收集的精液做一定稀釋后對處于發情期的3頭母豬進行輸精。在配種后不同時間段，分別用外部檢查法、陰道檢查法、孕酮檢查法及子宮頸粘液檢測法對人工授精后的母豬進行檢測，觀察其是否授精成功。

1.7初生仔豬鑒定

分別取所產仔豬耳部組織，倒入少量液氮迅速研磨，PBS制成乳懸液，基因組提取試劑盒提取DNA，選用GFP基因引物序列進行PCR擴增；另根據GenBank上豬的Lp-PLA和GAPDH基因序列分別設計一對引物， 引物序列見表1； 用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒配制反應體系，用熒光定量PCR儀進行擴增； 反應程序為94 ℃預變性5 min，以下按94 ℃變性50 s，52 ℃退火50 s，72℃延伸1 min共進行30個循環，最后72 ℃延伸10 min。

表1　引物序列Table 1　Primer sequences

2　結果

2.1質粒鑒定

2.1.1PCR鑒定用RT-PCR對質粒DNA和空載體鑒定，大量提取的質粒可以檢測到1 025 bp的目的條帶（圖2）。

2.1.2免疫熒光檢測質粒轉染293T細胞， 該質粒可以轉染細胞， 并在免疫熒光顯微鏡下呈綠色（圖3）。

2.2術后公豬精液檢測

2.2.1精液DNA檢測 注射后第2周起對精液DNA進行PCR擴增，觀察是否有外源基因的導入以及導入的時間。GFP基因于接種后第4周首現并持續至第16周（圖4）。

圖2　質粒PCR檢測Figure 2　PCR detection on the plasmid

2.2.2精液熒光顯微鏡檢測熒光鏡檢可觀察到表達GFP蛋白的精子，GFP蛋白主要表達于精子頂體后區及精子尾頸部（圖5）。

2.3仔豬鑒定

2.3.1仔豬PCR鑒定分別提取21頭仔豬DNA，進行PCR擴增，結果如圖6所示，21頭仔豬中4、6、7、10、12、13、14、17、20號豬均可檢測到GFP表達，總陽性率達42.86%。

2.3.2仔豬Real-time PCR檢測 轉基因豬樣品及內參GAPDH基因均擴增良好，其溶解曲線未見雜峰，通過電腦中輸出的Ct值判定結果，根據公式△Ct=CtPLA2-CtGADPH計算轉基因豬與對照之比的相對表達量， 結果如圖7所示， 4、6、7、10、12、13、14、17、20號豬Lp-PLA的表達量均明顯升高。

3　討論

我國具有獨特而又豐富的小型豬資源，它們在原產地均為長期近親交配形成的封閉群體，具有體型小發育慢、性成熟早，遺傳穩定，耐粗飼等特點，與國外的多品種雜交小型豬相比，具有明顯的優勢。以特有小型豬資源為基礎，進行封閉繁育，不僅保存了珍貴的品種資源，而且使品種遺傳及表型特征更加穩定，更加符合生命科學研究的要求，達到了保種與選育的雙重目的［5，6］。

圖3　質粒免疫熒光檢測Figure 3　Immunofluorescence detection on plasmid

圖4　不同時期豬精液DNA檢測Figure 4　Pig sperm DNA detection　at different periods

圖5　精液免疫熒光檢測Figure 5　Immunofluorescence detection on semen

1: 陽性對照； 2: 陰性對照； 3～23: 仔豬DNA圖6　轉基因豬PCR鑒定結果1: Positive control； 2: negative control； 3-23: piglet DNAFigure 6　PCR identification to transgenic pig

睪丸內注射轉基因法［7］是將外源DNA直接注射到雄性動物睪丸內， 轉染各個發生階段的生精細胞，轉染精子經體內成熟后采用自然交配或人工授精獲得轉基因動物。睪丸多點注射法由Yamazaki等［8］率先使用，并獲得了轉基因小鼠。Yin等［9］通過該法使外源基因在精子中穩定的高表達。本研究以巴馬小型豬為對象， 成功建立了睪丸注射方法，其術后精液質量未受影響， GFP基因于第4周首現并持續至第16周， 與豬精液生長周期一致。進一步通過免疫熒光檢測精子DNA雙鏈完整性，結果GFP基因顯色明顯，精子DNA完整性好，為后期人工授精做準備。由此可見， 本方法具有較好的發展前景。

1號: 陽性對照； 2號: 陰性對照； 3～23號: 仔豬圖7　轉基因豬RT-PCR鑒定No.1: positive control； No.2: negative control； No.3-23: piglet DNAFigure 7　RT-PCR identification on transgenic pigs

BMP是趨磁細菌細胞內合成的納米磁性顆粒，在固定化酶載體、制備磁性細胞、免疫檢測、基因轉移、DNA和RNA的分離和標記等幾方面已進行了較多研究［10-12］，但在轉基因方面的應用較少。現有研究表明［13］，將PEI與BMP顆粒結合后，通過外加磁場進行靶向基因導入，可有效提高轉染效率和基因表達水平。當把與BMP-PEI連接的目的基因導入BHK-21細胞或小鼠肌肉組織，不僅使蛋白成功表達，而且轉基因過程中靶細胞的死亡率始終保持在較低的水平，從而大大提高了轉基因的成功率。在外加磁場作用下，transMAGPEI的轉染效率比普通載體高幾百倍，體內實驗也證實［14］其轉染效率明顯提高。唐秋莎等［15］將質粒DNA與PEI修飾的錳鋅鐵氧體磁性納米粒子結合形成復合物后，進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，PEI修飾后的錳鋅鐵氧體磁性納米粒能與DNA有效結合。Soeren等［16］將含有熒光素酶基因的PCMVluc質粒與包被PEI的超順磁性納米顆粒形成復合物，轉染豬的呼吸道上皮細胞，發現磁性納米顆粒的轉化效率分別比PEI和脂質體Lipofectamine介導的轉染效率高400倍和2 500倍，并且磁顆粒與轉染細胞孵育很短時間就得到了轉基因的表達，孵育5 min時就有明顯的表達，孵育15 min時轉化效率達到最高。在國內，首都醫科大學實驗動物中心在合成BMPs-PEI-HMGR-shRNA-1568的基礎上， 通過睪丸注射法導入小鼠睪丸， 獲得了高效率的轉基因陽性小鼠， 并證實細菌磁小體是一種良好的攜帶外源基因的納米材料， 經睪丸注射可快速高效地生產基因修飾動物。因此， 把PEI等基因導入載體與磁性納米顆粒結合而形成的新型基因導入載體具有極大的應用前景。

本研究利用BMP的趨磁性和較強的吸附DNA能力，結合PEI 轉染效率高且不易降解等特點，制備BMP-PEI-GFP復合物； 通過睪丸注射法接種巴馬小型豬，對所產21頭仔豬，進行PCR鑒定，結果GFP表達的總陽性率達42.86%，提示由磁小體介導的轉基因豬成功構建。可見，BMP和PEI結合可作為良好的攜帶外源基因的非病毒性載體，用該載體通過精子介導法可以達到迅速制備轉基因豬的目的，其成本低、方法簡單、便捷。

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Producing Transgenic Pig by Bacteria Magnetic Particles

CHEN Ke-yan1， CHEN Zhen-wen2， DONG Wan-wei1， ZHENG Zhi-hong1
（1. Laboratory Animal Center， China Medical University， Shenyang 110032， China； 2. Department of Laboratory Animal Science， Capital University of Medical Sciences， Beijing 100069， China）

ObjectiveTo establish sperm-mediatedtransgenic pigs models by intratestis injection with bacteria magnetic particles （BMP） and polyethylenimine （PEI） as a vector. MethodThe Lp-PLA2-GFP plasmid were mixed with BMP-PEI to BMP-PEI- PLA2-GFP， which were delivered into Bama Mini-pigs by intratestis injection. The sperm were collected in 2 weeks， 4 weeks， 6 weeks to 20 weeks after inoculation， and the GFP gene weredetected by RT-PCR and immunofluorescence. The positive sperms will be transferred through artificial insemination to sows to establish transgenic pigs. The piglets were detected by RT-PCR to GFP gene and Real-time PCR to Lp-PLA2 gene. ResultsThe GFP gene was first appearance in semen in 4 weeks after inoculation， and sustained through 16 weeks. The GFP protein mainly expressed in the sperm acrosome， sperm tail and neck area were observed by fluorescence microscopy. Through artificial insemination， 21 piglets were born， 9 of which were found with GFP segments， and the expression of PLA2 was obviously higher than that of other pigs， with a total positive rate of 42.86%. ConclusionThe BMP combined with PEI can serve as a good non viral vector carrying exogenous gene， and sperm-mediated method with the vector can achieve the purpose of rapid preparation of transgenic pigs， its cost is low， the method is simple and convenient.

Pig； Transgenic； Bacteria magnetic particles （BMP）； Polyethylenimine （PEI）；Sperm-mediated gene transfer

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.005

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0288-06

2015-05-31

國家自然青年科學基金項目（31201758），中國博士后基金（2012M521919）

陳克研（1983-）， 男， 博士， 講師， 主要從事實驗動物學研究。E-mail: chenkeyan888@163.com