金黃倉鼠Apoa5基因表達載體的構建及在不同組織器官中的差異表達

董婉維， 張婀娜， 郭曉沖， 魏政立， 楊　葳， 周生來， 趙　文， 鄭志紅

（中國醫科大學實驗動物部， 沈陽　110001）

金黃倉鼠Apoa5基因表達載體的構建及在不同組織器官中的差異表達

董婉維， 張婀娜， 郭曉沖， 魏政立， 楊葳， 周生來， 趙文， 鄭志紅

（中國醫科大學實驗動物部， 沈陽110001）

目的構建金黃倉鼠載脂蛋白A5（Apoa5）基因表達載體以及在不同組織中的表達差異分析，為深入研究Apoa5基因在金黃倉鼠不同組織中功能奠定基礎。方法提取金黃倉鼠肝臟組織總RNA，采用RT-PCR方法對金黃倉鼠Apoa5基因的cDNA進行克隆，構建Apoa5基因表達載體并將其轉染293T細胞，分別采用RT-PCR和Western blot方法檢測mRNA及蛋白質表達水平。采用熒光定量PCR檢測并分析Apoa5 mRNA在8個組織中的表達量。結果經PCR檢測鑒定，Apoa5基因表達載體構建成功， 經測序分析金黃倉鼠Apoa5基因cDNA全長1 243 bp， 編碼366個氨基酸，與人、大鼠、小鼠等物種比對，核苷酸和氨基酸序列均具有較高的同源性，金黃倉鼠與人、大鼠、小鼠的氨基酸同源性分別為75%、84%、84%。轉染293T細胞48 h后，RT-PCR和Western blot結果表明，Apoa5基因在mRNA和蛋白質水平都有表達。熒光定量PCR結果顯示，Apoa5 mRNA在肝臟表達量最高，在腦和睪丸中中度表達，在心、脾臟、肺、腎、卵巢組織中低度表達。結論 成功構建Apoa5基因表達載體并分析其在不同組織中的表達差異，為制備Apoa5轉基因金黃倉鼠動物模型以及研究Apoa5基因在金黃倉鼠脂類代謝中的功能奠定基礎。

金黃倉鼠； 載脂蛋白A5（Apoa5）； 基因表達

載脂蛋白A5（Apolipoprotein A5，APOA5）基因最初是2001年由Pennacchio等［1］和Vilet等［2］兩個獨立研究小組通過比較人與小鼠基因組DNA時發現的一種新載脂蛋白基因。最近研究表明Apoa5基因被科學家們視為影響血脂水平的關鍵物質［3］。研究人員應用轉基因和基因敲除技術分別制備了人APOA5過度表達和基因缺失的小鼠模型，結果顯示兩種模型對血漿甘油三酯（triglyceride，TG）水平的影響作用相反，Apoa5轉基因小鼠的TG水平僅為同窩對照鼠的1/3，而Apoa5基因敲除小鼠血漿TG水平升高4倍［4］。它是第一個明確能夠降低血漿TG的載脂蛋白［5］。因此，對Apoa5基因進行深入研究探索Apoa5基因與血脂代謝的關系有著深遠的意義。目前，對血脂異常等心腦血管疾病的研究主要集中在人和大、小鼠動物模型，而在金黃倉鼠（Golden hamster， Mesocricetus auratus）上的研究很少。金黃倉鼠在脂類代謝及脂蛋白代謝受體基因序列上更接近人類，是研究血脂代謝的理想的動物模型［6］。本研究對金黃倉鼠Apoa5基因進行克隆，并構建Apoa5基因表達載體，同時分析其在不同組織中的表達差異，為制備Apoa5轉基因金黃倉鼠動物模型以及研究Apoa5基因在金黃倉鼠脂類代謝中的功能奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物本試驗所用10周齡SPF級金黃倉鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供［SCXK（京）2012-0001］。

1.1.2主要試劑293T細胞株（中科院上海細胞所）、大腸桿菌菌株DH5α、DMEM， 胎牛血清、胰蛋白酶、脂質體3000（pEF6/V5-His TOPO載體購自Invitrigen公司）， 限制性內切酶、Q5?High-Fidelity DNA Polymerase（購自NEB）、RT-PCR Kit購自Promega。V5 tag 抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1Apoa5表達載體構建提取10周齡金黃倉鼠肝臟組織總RNA，經逆轉錄酶反轉為cDNA。根據NCBI檢索到預測的金黃倉鼠Apoa5基因全長cDNA序列，設計針對Apoa5開放閱讀框（ORF） 的特異引物，上游引物內含ATG起始密碼； 在下游5'-端不加入終止密碼， 利用載體上的終止密碼。P1: 5'-GTACATCATGGTAAGCATGGC-3'； P2: 5'-GAGTTGAGGAGGCTGGCTAGG-3'。經PCR擴增后，將純化后的PCR 產物與載體pEF6/V5-His TOPO連接， 連接產物轉化感受態細菌Top10， 挑取白色單菌落擴增， 酶切鑒定連接方向并測序鑒定。將測序準確的重組表達載體pEF6/V5-His-Apoa5，經擴增后用Qiagen miniprep 試劑盒大量提取質粒，-20℃凍存備用。

1.2.2細胞轉染將5×106的293T細胞接種于6孔板， 待細胞長至90%匯合時， 經脂質體IpofectamineTM3000 Reagent 介導， 分別將pEF6/V5-His-Apoa 5（1 μg）和空載體（1 μg）轉染293T細胞。轉染48 h后收集細胞。

1.2.3RT-PCR檢測Apoa5基因在293T細胞中的表達轉染后48 h分別提取每組轉染293T細胞的總RNA。總RNA的提取采用Gibco 公司的Trizol試劑，按說明書操作方法進行， 經瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 無降解， 紫外分光光度計測定濃度后，以每管2 μg RNA用于反轉錄。利用Promega公司逆轉錄試劑盒將總RNA 反轉錄成cDNA 第一鏈。然后以Actin 作為內參照進行PCR 擴增。Apoa5基因RT-PCR引物P1: 5'- GGAAGGGCTTCTGGGACTAC-3'； P2: 5'-TGGTGCTTCACTCGTCTTTG-3'， 擴增片段471 bp。Actin片段大小為248 bp 。PCR 擴增條件為: 94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s， 58 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s， 共28個循環， 最后72℃10 min， 然后用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析結果。

1.2.4Western blot 檢測Apoa5基因在293T細胞中的表達共轉染48 h 后， 提取重組質粒pSuper-shFank1 631#與pdsRED-Fank1共轉染組， pSuper-shFank1 247# 與pdsRED-Fank1共轉染組、陰性對照組和空白對照組細胞的總蛋白。培養細胞用冰預冷的PBS 洗2 次后加入裂解液， 冰浴15 min ， 將裂解物10 625×g 離心10 min 后收集上清。在10%SDS-PAGE上分離總蛋白， 然后將蛋白質電轉移至PVDF膜上。經5%脫脂奶粉封閉后， 與羊抗鼠V5tag 抗體室溫孵育2 h，再經洗膜， 并與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育， 最后經ECL發光反應， 并曝光于X光片上。

1.2.5熒光定量PCR測定Apoa5基因mRNA的相對表達量分別提取10周齡金黃倉鼠心、肝臟、脾、肺、腎、腦、卵巢、睪丸共8個組織的總RNA，經逆轉錄酶反轉為cDNA。將cDNA稀釋10倍作為PCR擴增模板， 使用TaKaRa SYBR Premix EX Taq TM試劑盒進行定量PCR檢測， 25 mL PCR反應體系中含: 上下游引物各1 mL，稀釋后cDNA 5 mL，SYBR Premix EX TaqTM 12.5 mL，加水補充至25 mL。PCR反應條件: 95 ℃ 1 min； 95 ℃ 5 s，60℃ 20 s，45個循環，在ABI 7500熒光定量PCR儀上同時檢測Apoa5及Actin表達水平，每個樣品做3個平行管， 每次實驗重復3次， 取平均值。Apoa5正向引物: 5'-GAAGTCCAGCAGCAGT-TAGC-3'； 反向引物: 5'- AGTGAACCTGAGTGAGTA-GACC 3'， 擴增產物為200 bp； Actin正向引物: 5'-GGCACCACACCTTCTACAAC-3'， 反向引物: 5'-TACGACCAGAGGCATACAGG-3'， 擴增產物為186 bp。

2　結果

2.1Apoa5表達載體的鑒定

提取金黃倉鼠肝臟組織總RNA，經甲醛變性凝膠電泳檢測可以觀察到可見28S、18S和5S三條條帶，28S約為18S的二倍，有較好的完整性，經逆轉錄酶反轉為cDNA，利用Apoa5引物擴增獲得了1 243 bp的目的片段（圖1）。將此目的片段與載體pEF6/V5-His連接，轉化，擴增并提取重組質粒DNA，BamH I和Xba I雙酶切產生2 條帶，大小分別約為5 840 bp 和1 243 bp （圖2） 。對重組質粒中Apoa5 ORF目的基因片段進行DNA序列測定，DNA序列與GeneBank上預測的Apoa5序列一致。

圖1　金黃倉鼠Apoa5 cDNA擴增結果

圖2　質粒經BamH I和Xba I雙酶切后電泳結果

2.2金黃倉鼠基因氨基酸序列的同源性比對

通過Blast軟件將已擴增出的金黃倉鼠Apoa5基因序列分別與人、大鼠、小鼠的Apoa5基因序列進行比較，分析結果顯示金黃倉鼠的Apoa5基因序列與人、大鼠及小鼠都具有較高的同源性，分別為78%，86%、85%。這4個物種的蛋白質長度也非常相似，金黃倉鼠與人的蛋白長度均為366個氨基酸，大鼠、小鼠分別為391和368個氨基酸應用Mega v4.1軟件中Clustal X程序進行比對，金黃倉鼠與人、大鼠、小鼠的氨基酸同源性分別為75%、84%、84%。

圖3　Apoa5基因的氨基酸序列比對分析結果

2.3pEF6/V5-His-Apoa5表達載體體外表達檢測結果pEF6/V5-His-Apoa5質粒轉染293T細胞后，抽提細胞總RNA進行逆轉錄反應，采用特異性引物擴增Apoa5片段， 得到Apoa5基因的目的條帶471 bp（圖4），轉染空載體組無目的條帶。同時利用抗V5單克隆抗體檢測Apoa5重組融合蛋白的表達。結果顯示，在293T細胞中表達的Apoa5重組融合蛋白能特異性結合V5單克隆抗體，融合蛋白在分子量120 000 處顯帶（圖5）。結果證明pEF6/V5-His-Apoa5融合表達載體能夠在293T細胞中進行mRNA和蛋白水平的表達。

圖4　Apoa5基因的氨基酸序列的系統進化樹

圖5　RT-PCR鑒定 pEF6/V5-His-Apoa5表達載體在293T細胞中表達

圖6　Western blot鑒定pEF6/V5-His-Apoa5表達載體在293T細胞中表達

2.4Apoa5基因在不同組織的mRNA表達差異分析

通過熒光定量PCR分析了Apoa5基因在金黃倉鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、卵巢、睪丸中的表達情況，Apoa5 mRNA在肝臟表達量最高，在腦和睪丸中均有中度表達，在心臟、脾臟、肺、腎、卵巢組織中低度表達。

圖7　Apoa5基因在不同組織的mRNA表達差異分析

3　討論

金黃倉鼠是一種小型嚙齒類動物。現已廣泛應用于生理學、腫瘤學、遺傳學、藥理學、毒理學等諸多生物醫學領域的科研實驗中［7］。金黃倉鼠脂蛋白結構與人相似，有研究認為［8］金黃倉鼠動脈硬化的病理過程與人類十分相似， 是研究糖尿病、高脂血癥、動脈硬化發生發展的良好動物模型。目前國內外關于血脂異常相關疾病的研究多取材于大鼠和小鼠。大鼠在血脂代謝與人類存在很大差異， 并且大、小鼠均有抗動脈硬化發生的能力。大鼠血脂水平個體差異較大， 經肝外合成內源性膽固醇比例僅占35%， 人類為90%。而金黃倉鼠的肝臟內源性膽固醇合成比例約為 85%， 與人類更為接近［6］，因此是目前較為公認的研究血脂代謝的動物模型。

Apoa5是近年來發現的載脂蛋白家族新成員，Apoa5經肝臟合成后分泌入血， 存在于高密度脂蛋白（HDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）和乳糜微粒中， 主要通過加速血漿總膽固醇（TG）清除及影響VLDL的合成分泌等途徑發揮調節血漿甘油三酯代謝的作用。Apoa5不僅在結合、轉運脂質及穩定脂蛋白的結構上發揮重要作用， 而且還調節脂蛋白代謝關鍵酶活性。參與脂蛋白受體的識別， 在脂類代謝中發揮極為重要的作用［9，10］。

本研究運用RT-PCR的方法獲得了金黃倉鼠Apoa5基因的cDNA全序列1 243 bp， 編碼366 個氨基酸，預測其蛋白分子量為40 140。通過基因序列分析表明，金黃倉鼠的cDNA片段與人、大鼠及小鼠都具有較高的同源性， 分別為78%、86%、85%， 且四者蛋白質的氨基酸長度也相似，金黃倉鼠與人的蛋白均為366個氨基酸，大鼠、小鼠分別為391和368個氨基酸，同源性分別為75%、84%、84%。這說明了Apoa5基因的保守性與其功能的重要性。通過熒光定量PCR分析了Apoa5基因在金黃倉鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、卵巢、睪丸中的表達情況， Apoa5 mRNA在肝臟表達量最高，在腦和睪丸中均有中度表達， 在心臟、脾臟、肺、腎組織中低度表達。人Apoa5基因同樣在肝組織表達， 定位在胞漿內，而在脾、血管、小腸、心臟、肺的表達呈陰性［11］， 與本實驗結果基本一致。本試驗結果表明金黃倉鼠Apoa5主要在肝臟中發揮作用，提示其具有組織特異性。肝臟是TG代謝的主要場所， 動物實驗和臨床研究證明， Apoa5在體內TG代謝過程中發揮重要作用［12］，但是Apoa5調節TG水平的確切機制目前尚未闡明。為了更進一步研究Apoa5在肝臟中的作用，作者將應用Apoa5基因表達載體， 建立金黃倉鼠Apoa5基因轉基因動物模型，Apoa5基因也許能作為預測心血管疾病的新指標和降低血脂濃度的治療靶點。

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Construction of Golden Hamster Apoa5 Gene Expression Vector and Its Expression in Different Organs

DONG Wan-wei， ZHANG A-nuo， GUO Xiao-chong， WEI Zheng-li，YANG Wei， ZHAO Wen， SHEN Wei，ZHENG Zhi-hong （China Medical University， Shenyang 110003， China）

ObjectiveTo construct apolipoprotein a5 （Apoa5） expressing plamid and describe the gene expression profile of Apoa5 in golden hamster. MethodsTotal RNA was extracted from liver tissue of golden hamster， cDNA of Apoa5 was cloned by RT-PCR， and then subcloned into plasmid. The plasmid of pEF6/V5-His-Apoa5 was transfected into 293T cells， the expression was examined by RT-PCR and Western blot. The expression of Apoa5 in 8 organs， including brain， heart， lung， liver，spleen， kidney， testis， and ovary of golden hamster were also detected by real time PCR. Results Apoa5 expression vector was constructed. Apoa5 mRNA and APOA5 protein was successfully detected in 293T cells 48 h after transfection. Sequencing results showed that the cDNA of Apoa5 contained 1 243 bp，it encodes 366 aa. The Apoa5 gene in golden hamster has high homology with human， mouse and rat. The Apoa5 gene in golden hamster shares 75%， 84%， 84% amino acids with human， rat， and mouse. Real time PCR results showed that gene expression of Apoa5 was high in liver， brain， testis， but low in heart， lung， and kidney. ConclusionThe Apoa5 expression vector was constructed successfully， and Apoa5 expression profile in golden hamster had been described. It may be as the foundation for establishing Apoa5 transgenic golden hamster and researching the function of Apoa5.

Golden hamster； Apolipoprotein A5（Apoa5）； Gene expression

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0283-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.004

2015-05-31

遼寧省科技計劃項目（2012408002）

董婉維（1979-）， 女， 動物學碩士研究生。E-mail: magicdww@163.com

鄭志紅（1969-）， 女， 博士，教授， 從事實驗動物轉基因與基因敲除研究。E-mail: zhihongzheng@163.com