應(yīng)用Talen法制備apoE基因敲除大鼠模型

徐影琪， 李曉晶， 楊　葳， 周生來， 于　洋，

王　惟1， 張婀娜1， 趙　文1， 張梅英1， 郭大勇2， 王宏宇2， 鄭志紅1

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部， 沈陽　110001； 2. 南京徇齊生物技術(shù)有限公司， 南京　210061）

應(yīng)用Talen法制備apoE基因敲除大鼠模型

徐影琪1， 李曉晶2， 楊葳1， 周生來1， 于洋1，

王惟1， 張婀娜1， 趙文1， 張梅英1， 郭大勇2， 王宏宇2， 鄭志紅1

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部， 沈陽110001； 2. 南京徇齊生物技術(shù)有限公司， 南京210061）

目的應(yīng)用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（Talen）法制備載脂蛋白E（apoE）基因敲除大鼠模型，為進(jìn)一步研究apoE基因功能，動脈粥樣硬化（AS）疾病發(fā)病機(jī)制及治療方法奠定基礎(chǔ)。方法設(shè)計并合成針對大鼠apoE基因的Talen序列，應(yīng)用原核顯微注射方法制備子代鼠。通過PCR-測序及TA克隆-測序法檢測仔鼠中apoE的突變，經(jīng)傳代及兄妹交配獲得純合型仔鼠，并對其基因型進(jìn)行鑒定。應(yīng)用Western blot方法檢測apoE-/-仔鼠各組織中ApoE蛋白表達(dá)水平； 血清學(xué)分析血脂總膽固醇（CHO）及甘油三酯（TG）含量； 應(yīng)用RT-PCR方法檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）的表達(dá)。結(jié)果經(jīng)鑒定選取在第二外顯子處缺失1 bp，造成開放閱讀框移碼突變的大鼠為陽性F0代仔鼠，該鼠經(jīng)傳代及篩選，最終獲得apoE-/-大鼠。Western blot檢測顯示apoE-/-鼠在心、肝、腎、腦、卵巢組織中未見ApoE蛋白的表達(dá)， 表明在該模型中成功實現(xiàn)了apoE基因的敲除。apoE-/-鼠血脂CHO、TG均高于野生SD大鼠，其中CHO水平呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。在apoE-/-鼠肝組織中ABCA1的表達(dá)降低，可能起到促進(jìn)AS形成的作用。結(jié)論應(yīng)用Talen法成功制備apoE基因敲除SD大鼠； 經(jīng)篩選獲得了純合型apoE-/-大鼠，該模型實現(xiàn)了apoE基因敲除，并表現(xiàn)為高血脂及AS性狀。

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（Talen）； 載脂蛋白E（ApoE）； 基因敲除； 大鼠

動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）的發(fā)生發(fā)展受多種遺傳和外界因素的影響， 血脂代謝異常是導(dǎo)致AS的重要始動因素之一。載脂蛋白（ apolipoprotein，Apo）在血漿總膽固醇（ cholesterol， CHO）和甘油三酯（triglyceride， TG）的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝中起關(guān)鍵作用。載脂蛋白E（apolipoprotein E， ApoE） 是清除乳糜微粒和極低密度脂蛋白受體的配體，缺乏ApoE蛋白會導(dǎo)致血液循環(huán)中富含膽固醇的物質(zhì)積累，而更加容易引起AS病灶形成。1992年，用于研究AS的載脂蛋白E（apoE）基因缺陷小鼠問世，有了研究AS較好的動物模型［1］。但由于受到大鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)困難的制約，利用同源重組法制備apoE基因敲除的大鼠模型比較困難。近年來，基因組編輯技術(shù)發(fā)展迅猛，為基因敲除的發(fā)展提供了良好的技術(shù)支持。轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcriptionactibator like effector nucleases， Talen）可以對DNA雙鏈分子進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂切口（DNA double-strand break），然后激活細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接（nonhomologous end joining）修復(fù)切口［2-5］，修復(fù)的結(jié)果常造成微小的基因片段插入或缺失，從而達(dá)到基因敲除目的。本研究應(yīng)用Talen法制備apoE基因敲除大鼠模型，篩選出純合子后檢測ApoE蛋白表達(dá)及血清中總膽固醇及甘油三酯含量，并檢測與AS發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）的表達(dá)，為AS相關(guān)致病機(jī)制的更進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗動物

顯微注射用5周齡SPF級大鼠和12～20周齡受體SD大鼠， 傳代用及對照組SD大鼠均來源于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2012-0001］。所有實驗用SD大鼠均在SPF級動物房飼養(yǎng)和繁殖， 溫度控制在24±2℃， 自動光控（L: D=12h∶12h，光照周期為7∶00～19∶00）［SYXK（遼）2013-0007］。

1.2試劑

礦物油（胚胎級）、M2培養(yǎng)基、M16培養(yǎng)基購自Sigma公司，孕馬血清促性腺激素（PMSG）購自寧波市激素制藥廠，人絨毛膜促性腺激素（hCG）購自上海生物生化制藥廠。引物合成自三博遠(yuǎn)志生物公司，dNTP Mixture、DNA聚合酶及配套反應(yīng)緩沖液、凝膠回收純化kit、pMD-18T載體及DNA連接酶kit、感受態(tài)DH5α（E.coli）、質(zhì)粒提取試劑盒購自大連寶生物公司。測序由南京金斯瑞公司完成。Western blot相關(guān)試劑為本室自存， ApoE抗體購自Santa cruz公司，二抗購自中杉金橋公司。總膽固醇（CHO）、甘油三脂測（TG）定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司。Trizol購自Invitrogen公司； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司。

1.3apoE基因敲除大鼠模型的建立

1.3.1顯微注射選取受精卵將針對apoE基因的Talen 片段注入原核。將注射后狀態(tài)良好的受精卵移植入假孕母鼠的輸卵管中， 等待F0代（founder）出生。

1.3.2 F0代大鼠的檢測

1.3.2.1PCR測序鑒定剪取出生15 d仔鼠尾組織，在蛋白酶K作用下55 ℃水浴搖床過夜消化，酚氯仿法抽提鼠尾基因組DNA，設(shè)計合成特異的檢測引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。正向引物: 5'-ACCAGCCTAGTCTCAGCTCT-3'； 反向引物: 5'-TAGGGTGGGAGGAAACCACA-3'，產(chǎn)物為670 bp。 反應(yīng)條件為: 94℃， 5 min； 94 ℃， 30 s， 60 ℃， 45 s， 72 ℃， 45 s， 34個循環(huán)； 72℃， 10 min， 應(yīng)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞公司測序。測序引物: 5'-ACCAGCCTAGTCTCAGCTCT-3'。

1.3.2.2TA克隆測序鑒定選取PCR測序結(jié)果出現(xiàn)套峰的F0代仔鼠編號， 進(jìn)行PCR-TA克隆實驗來進(jìn)一步鑒定。根據(jù)T載體說明書， 擴(kuò)增PCR片段， 引物同PCR檢測； 產(chǎn)物純化后將該片段連接入pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α， 經(jīng)藍(lán)白斑篩選出成功插入T載體中的克隆。挑取6～10個克隆，搖菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后進(jìn)行測序分析。測序引物為載體通用引物M13-47。測序結(jié)果與apoE基因野生型序列進(jìn)行比對， 進(jìn)而確定陽性F0代（founder）的編號。

1.4篩選純合型apoE基因敲除大鼠

采用經(jīng)典育種與PCR-測序檢測相結(jié)合的方法進(jìn)行apoE基因敲除鼠純合子篩選。將陽性原代鼠（founder， F0代）與野生型SD大鼠配種進(jìn)行繁殖，出生仔鼠為F1代。F1代中PCR測序結(jié)果出現(xiàn)套峰，并與F0代相同的鼠判定為陽性。F1代仔鼠同胞交配，出生仔鼠為F2代。F2代仔鼠經(jīng)鼠尾DNA提取，PCR測序檢測，結(jié)果無套峰，與野生型序列相比出現(xiàn)插入或缺失，并且插入或缺失的情況與原代鼠TA克隆結(jié)果一致的編號判定為純合型。

1.5Westen blot檢測ApoE蛋白的表達(dá)

apoE-/-大鼠及對照野生型SD大鼠頸椎脫臼處死后，分別取心、肝、腎、腦、卵巢組織，提取各組織總蛋白，應(yīng)用Western blot方法檢測各組織中ApoE蛋白的表達(dá)水平。

1.“取長”則需要“知長”。教師、學(xué)生、知識體系的三維體系極大地推動了“互動式教學(xué)模式”的運(yùn)用，相比較于傳統(tǒng)的知識傳授方式，“人機(jī)互動”方式更有利于加強(qiáng)對教學(xué)資源的整合。而伴隨著云時代成長起來的學(xué)生，則對這種教學(xué)形式有著天然的好感。他們對認(rèn)識世界的需求需要大量的社會資源做鋪墊，且教師也可以通過這一平臺隨時了解學(xué)生的學(xué)習(xí)情況。有了“人機(jī)互動”的平臺，這些原本近在咫尺卻很難獲得的教學(xué)資源自然而然就成為學(xué)生隨手可以獲取的財富。

1.6apoE-/-鼠及對照野生型鼠血脂CHO及TG檢測

實驗組為apoE-/-大鼠， 對照組為野生型SD大鼠， 每組4只， 均為6～7月齡。眼眶靜脈叢取血獲得apoE-/-大鼠及野生型SD大鼠血液， 室溫3 000 r/min離心20 min，取上清即為血清樣品，按照血脂CHO 及TG測定試劑盒步驟進(jìn)行檢測，后應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗方法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.7ABCA1的表達(dá)檢測

應(yīng)用Trizol法提取apoE-/-大鼠及野生型SD大鼠肝組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，后經(jīng)PCR檢測ABCA1的表達(dá)。PCR引物見表1。PCR反應(yīng)條件為: 94℃， 5 min； 94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，30個循環(huán)； 72℃，10 min，應(yīng)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1apoE-/-大鼠基因型鑒定

測序結(jié)果應(yīng)用NCBI Blast工具進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)apoE-/-大鼠中apoE基因在第二外顯子處缺失1 bp，這將造成移碼突變，進(jìn)而實現(xiàn)了apoE基因的敲除。結(jié)果見圖1，缺失部分用藍(lán)色標(biāo)識。

表1　RT-PCR引物序列及產(chǎn)物長度

2.2apoE-/-大鼠各組織中ApoE蛋白表達(dá)檢測

Western blot結(jié)果表明， 在apoE-/-大鼠的心、肝、腎、腦、卵巢組織中， ApoE未表達(dá)， 而野生型SD大鼠中可見ApoE的表達(dá)， 這說明該模型鼠實現(xiàn)了apoE基因在表達(dá)水平的敲除， 證明該敲除模型良好（圖2）。

apoE-/-大鼠血脂CHO水平顯著高于野生型大鼠（P＜0.05），TG水平略高于野生型大鼠，但無顯著性差異（P＞0.05）（表2）。

2.4ApoE對ABCA1的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，apoE-/-大鼠肝組織中ABCA1表達(dá)降低（圖3）。

3　討論

圖1　apoE-/-大鼠測序結(jié)果與野生型序列比對結(jié)果

圖2　apoE-/-大鼠及野生型SD大鼠各組織中ApoE蛋白的表達(dá)

表2　大鼠血脂CHO及TG含量檢測

圖3　apoE-/-大鼠及對照野生型SD大鼠肝組織中ABCA1 的表達(dá)

AS動物模型的建立對于AS致病機(jī)制的研究及治療藥物的篩選具有重要意義。以往的AS 動物模型多采用大量脂肪、膽固醇負(fù)荷的大鼠或小鼠制作，但由于大鼠或小鼠先天具有抵抗膽固醇的特性， 在制作模型時膽固醇負(fù)荷往往是20倍于正常膳食的急性過程，這與人類實際的慢性高脂血癥情況相差甚遠(yuǎn)［6，7］。隨著分子生物學(xué)和動物實驗胚胎學(xué)的發(fā)展和相互滲透促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型被人們普遍認(rèn)為是解析人類基因組功能的重要技術(shù)手段之一。而大鼠體型較大，更適合體內(nèi)成像、電生理手術(shù)等操作， 尤其在生理某些行為、代謝等方面更接近人類， 所以大鼠是某些心腦血管疾病研究、毒理學(xué)研究、神經(jīng)學(xué)和行為學(xué)研究理想的動物模型［8］， 然而， 由于受胚胎干細(xì)胞操作的限制， 目前用于AS研究的基因缺陷大鼠模型很少。本實驗中采用大鼠制備AS相關(guān)的基因缺陷模型， 以期建立一個更適于AS研究的新模型。

ApoE是脂質(zhì)代謝中重要的參與者。缺乏ApoE會導(dǎo)致血液循環(huán)中富含膽固醇的物質(zhì)積累， 總膽固醇、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白含量升高［9］，進(jìn)而形成嚴(yán)重的高脂血癥及AS病灶。這在小鼠模型中已經(jīng)被證實， 因此本實驗中選擇制備apoE基因敲除的大鼠模型。

近年來，位點(diǎn)特異性核酸切割酶技術(shù)獲得飛速發(fā)展，為基因組精確編輯帶來了革命性的變化，也為大鼠基因敲除模型的建立提供了新的方法。位點(diǎn)特異性核酸切割酶包括鋅指核酸酶（ZFN）、Talen和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列系統(tǒng)（CRISPR/Cas system），通過識別特定的DNA序列進(jìn)行切割進(jìn)而引發(fā)突變， 實現(xiàn)對基因組的精確修飾。Talen技術(shù)主要是應(yīng)用轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)與DNA的特異性結(jié)合［10］。轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子是黃單胞菌進(jìn)入植物細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，由多個能夠特異性識別DNA的串聯(lián)“蛋白質(zhì)模塊”和兩側(cè)的N 端及C 端序列組成。每一個蛋白質(zhì)模塊包括34個氨基酸，第12和13位氨基酸殘基負(fù)責(zé)識別單個的脫氧核糖核苷酸。因此，當(dāng)足夠多的蛋白質(zhì)模塊串聯(lián)在一起時，就能夠特異性地識別一段DNA序列［11，12］。2011年，Tesson 等［13］通過Talen的胚胎顯微注射成功獲得了基因敲除的大鼠。Talen和ZFN相比，識別位點(diǎn)更廣泛，幾乎可以敲除所有的基因；剪切效率更高，在Tesson等［13］研究中，使用Talen法陽性率為59%，而相應(yīng)的使用ZFN方法的成功率為19%。故本實驗中應(yīng)用Talen方法制備apoE基因敲除大鼠，成功獲得了apoE基因移碼突變的大鼠，經(jīng)育種篩選出純合型仔鼠。本研究獲得的apoE-/-大鼠中ApoE蛋白在心、肝、腎、腦、卵巢等組織未見表達(dá)，初步證明該模型實現(xiàn)了apoE基因的剔除。

大鼠血脂總膽固醇（CHO）及甘油三酯（TG）水平與其性別、年齡、營養(yǎng)狀況及飼養(yǎng)條件等均有關(guān)［14］，日齡越大， 體質(zhì)量越大，其CHO及TG水平越高。6～7月齡大鼠已完成發(fā)育階段，相當(dāng)于人類成年階段［15］，生理指標(biāo)趨于穩(wěn)定，日齡差異對血脂CHO 及TG水平的影響變小，而此時，體質(zhì)量對血脂CHO及TG水平的影響變大， 故本研究中， 作者選擇體質(zhì)量近乎相同的野生型大鼠作為對照。經(jīng)檢測，apoE-/-大鼠CHO含量顯著高于野生型大鼠（P＜0.05），表明該模型鼠呈現(xiàn)高血脂狀態(tài)。apoE-/-大鼠TG含量也高于野生型大鼠， 但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與該模型大鼠未經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)有關(guān)。

ABCA1為膜整合蛋白， 以 ATP 為能源將胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)到胞膜， 最終與附在細(xì)胞表面的載脂蛋白 AI （apoprotein AI， ApoAI）結(jié)合［16］， 這一過程對于減少血管壁脂質(zhì)蓄積泡沫細(xì)胞形成和血管壁炎癥反應(yīng)均具有重要意義。在C57BL/6小鼠中， Joyce等［17］最先證明了ABCA1過表達(dá)具有抗AS作用，過表達(dá)肝臟和巨噬細(xì)胞ABCA1后，明顯抑制主動脈AS斑塊的進(jìn)展。Miranda等［18］利用低密度脂蛋白敲除小鼠， 觀察了巨噬細(xì)胞過表達(dá)ABCA1對高密度脂蛋白水平和AS的影響，結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞過表達(dá)ABCA1 明顯減少小鼠AS斑塊的進(jìn)展，但對高密度脂蛋白的水平?jīng)]有明顯影響。而ABCA1基因敲除動物不僅表現(xiàn)出低的血漿高密度脂蛋白水平，還表現(xiàn)出胰腺β細(xì)胞功能紊亂、體內(nèi)促炎狀態(tài)和AS斑塊的形成。多種促AS的炎癥因子和代謝產(chǎn)物可能通過下調(diào)ABCA1的表達(dá)， 從而促進(jìn)AS相關(guān)心血管疾病的發(fā)展［19，20］。選擇性地敲除巨噬細(xì)胞ABCA1可顯著增加apoE敲除和低密度脂蛋白受體敲除小鼠AS的進(jìn)展， 在此過程中巨噬細(xì)胞膽固醇流出的另外兩個受體ABCG1和清道夫受體BI （SR-BI） 起著重要的協(xié)同作用［21，22］。本研究中，apoE-/-大鼠肝組織中，ABCA1在mRNA水平表達(dá)降低，這可能起到促進(jìn)AS發(fā)展的作用。

綜上，作者應(yīng)用Talen方法制備apoE基因敲除的大鼠模型，并獲得了純合型仔鼠，經(jīng)過一系列實驗證實該大鼠模型表現(xiàn)出高血脂及AS表型該模型為進(jìn)一步更好地研究apoE基因功能及深入了解AS致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

［1］Plump AS， Smith JD， Hayek T， et al. Severe hypercholester olemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mic created by homologous recombinetion in ES Cells ［J］. Cell 1992， 71（10）:343-353.

［2］Christian M， Cermak T， Doyle EL， et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases［J］Genetics， 2010， 186（2）:757-761.

［3］Urnov FD， Rebar EJ， Holmes MC， et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases［J］. Nat RevGenet， 2010， 11 （9）:636-646.

［4］Miller JC， Tan S， Qiao G， et al.A TALE nuclease architectur for efficient genome editing［J］. Nat Biotechnol， 2011， 29（2）143-148.

［5］Mahfouz MM， Li L， Shamimuzzaman M， et al. De novo engineered transcription activator-like effector （TALE hybrid nuclease with novel DNA binding specificity create double-strand breaks ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2011， 108 （6）:2623-2628.

［6］Breslow JL. Mouse models of atherosclerosis ［J］. Science 1996， 272（5262）:685-688.

［7］劉雪梅， 吳符火. 幾類高脂血癥動物模型的比較［J］ . 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報， 2004， 2（2）:132-134.

［8］Zheng S， Geghman K， Shenoy S， et al. Retake the cente stagenew development of rat genetics ［J］. Genet Genomics 2012， 39（6）:261-268.

［9］Zhang SH， Reddick RL ， Piedrahita JA ， et al. Spontaneou hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking aopolipoprotein E［J］. Science， 1992， 258 （10）:468-471.

［10］ Mahfouz MM， Li L， Shamimuzzaman M， et al. De novo engineered transcription activator-like effector （TALE） hy brid nuclease with novel DNA binding specificity create double-strand breaks［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2011， 108 （6）: 2623-2628.

［11］ Boch J， Scholze H， Schornack S， et al. Breaking the code o DNA binding specificity of TAL-type III effectors［J］. Science 2009， 326（5959）:1509-1512.

［12］ Moscou MJ， Bogdanove AJ. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors［J］. Science， 2009， 326（5959）1501.

［13］ Tesson L， Usal C， Menoret S， et al. Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs［J］. Nat Biotechnol 2011， 29（8）:695-696.

［14］ 鄒移海， 陳嘉， 謝玲玲， 等. 實驗性大鼠血脂檢測［J］ . 實驗動物科學(xué)與管理， 2004， 21（1）:4-5.

［15］ 施新猷. 醫(yī)用實驗動物學(xué)［M］. 北京: 人民軍醫(yī)出版社， 1999: 388.

［16］ Yin K， Liao DF， Tang CK. ATP-binding membrane cassettetransporterA1 （ABCA1）: a possible link between inflammation and reverse cholesterol transport［J］. Mol Med，2010， 16（9-10）:438-449.

［17］ Joyce C， Freeman L， Brewer HB， et al. Study of ABCA1 function in transgenic mice［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2003， 23（6）:965-971.

［18］ Van Eck M， Singaraja RR， Ye D， et al. Macrophage ATP-binding cassette transporter A1 overexpression inhibits atherosclerotic lesion progression in low-density lipo-protein receptor knockout mice［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006， 26（4）:929-934.

［19］ Coutinho JM， Singaraja RR， Kang M， et al. Complete functional rescue of the ABCA-/-mouse by human BAC transgenesis［J］. J Lipid Res， 2005， 46（1）:113-123.

［20］ van Eck M， Bos IS， Kaminski WE， et al. Leukocyte ABCA1 control susceptibility to atherosclerosis and macrophage recruitment into tissues［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2002，99 （6）:298-303.

［21］ Zhao Y， Pennings M， Hildebrand RB， et al. Enhanced foam cell formation， atherosclerotic lesion development， and inflammation by combined deletion of ABCA1 and SR-BI in bone marrow-derived cells in LDL receptor knockout mice on western-type diet［J］. Circ Res， 2010， 107（12）:e20-31.

［22］ Out R， Hoekstra M， Habets K， et al. Combined deletion of macrophage ABCA1 and ABCG1 leads to massive lipid accumulation in tissue macrophages and distinct atherosclerosis at relatively low plasma cholesterol levels［J］. Arteioscler Thromb Vasc Biol， 2008， 28（2）:258-264.

Establishment of apoE Gene Knockout Model on SD Rat Using Talen Method

XU Ying-qi1， LI Xiao-jing2， YANG Wei1， ZHOU Sheng-lai1， YU Yang1， WANG Wei1， ZHANG E-nuo1，

ZHAO Wen1， ZHANG Mei-ying1， GUO Da-yong2， WANG Hong-yu2， ZHENG Zhi-hong1
（1. Laboratory Animal Center， China medical university， Shenyang 110001， China；2. SyncBiotech Co. Ltd， Nanjing 210061， China）

Objective To establish the apoE gene knockout-rat model using Talen method， and provide a basis for further study on the function of the apoE gene， the pathogenesis and treatment of atherosclerotic disease. Methods The Talen sequences were designed and synthesized for the rat apoE gene， and then the linearized and purified fragments were injected into fertilized eggs of SD rat through microsopic injection. Positive rats were detected by PCR-sequencing and TA clone-sequencing. The homozygous type offspring were obtained by siblings mating， and the genotype was identified. Western blot was used to detect the expression level of ApoE protein in some tissues of apoE-/-rat. The plasma levels of total cholesterol and triglyceride levels have also been detected. The expression of ATP binding cassette transporter A1 （ABCA1） which was related to the lipid metabolism was detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR）. ResultsSequencing analysis indicated that there had a deletion of 1 bp in the second exon， resulting in open reading frame shift mutation in the rat， and obtained the apoE-/-rats. Western blot test showed that no expression of ApoE protein in the heart， liver，kidney， brain and ovary of apoE-/-rats， and the apoE gene was successfully knocked out. The total cholesterol and triglyceride levels of apoE-/-rats were higher than that of wild type SD rats， and the total cholesterol levels have the significantly different （P＜0.05）. The expression of ABCA1 in the liver of the apoE-/-rats was decreased， which may play a role of AS promoting. ConclusionsapoE-/-rats were obtained by Talen method. The apoE gene has been knocked out， and the rats can be considered as the model rats showed hyperlipemia and atherosclerosis.

Talen； Apolipoprotein E （ApoE）； Gene knockout； Rat

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.003

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0277-06

2015-05-31

國家重大科技專項（2011ZX09307-302-02）， 遼寧省科技計劃項目（2013408001）

徐影琪（1985-）， 女， 碩士， 助教。E-mail: xuyq706@163.com

鄭志紅（1969-）， 女， 博士， 教授， 從事實驗動物轉(zhuǎn)基因及基因敲除研究。E-mail: zhihongzheng@163.com王宏宇（1974-）， 女， 博士， 從事基因編輯技術(shù)及代謝紊亂機(jī)制的研究。E-mail: xunqi@nbri-nju.com