eNOS基因敲除大鼠模型的建立及表型初步研究

楊　葳， 周生來， 董婉維， 王　惟， 于　洋， 郭曉沖， 張婀娜， 王宏宇， 鄭志紅

（1. 中國醫科大學實驗動物部， 沈陽　110001；　2. 南京徇齊生物技術有限公司， 南京　210061）

eNOS基因敲除大鼠模型的建立及表型初步研究

楊葳1， 周生來1， 董婉維1， 王惟1， 于洋1， 郭曉沖1， 張婀娜1， 王宏宇2， 鄭志紅1

（1. 中國醫科大學實驗動物部， 沈陽110001；2. 南京徇齊生物技術有限公司， 南京210061）

目的建立內皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因敲除大鼠模型。方法利用鋅指核酸酶（ZFN）技術，通過顯微注射的方法將編碼eNOS特異性鋅指酶的mRNA注入SD大鼠受精卵并移植到同期受孕的SD受體母鼠輸卵管內。出生后仔鼠用PCR產物測序的方法鑒定基因型。對敲除大鼠進行外觀觀察，HE染色分析組織結構形態。通過Western blot分析敲除大鼠模型的心臟和腎臟組織中eNOS的表達情況。測量8～16周大鼠體質量，分析eNOS基因敲除對體質量的影響。采用尾套法測量大鼠心率、血壓、收縮壓和舒張壓，比較與野生型大鼠的差異。結果通過顯微注射方法共注射441枚受精卵，存活365枚，分別移入12只SD大鼠輸卵管，共產出23只F0代大鼠。PCR產物測序分析獲得4只陽性原代大鼠，對8號大鼠篩選獲得純合子。陽性純合子大鼠表現為肢體缺損，HE染色顯示動脈血管結構形態異常。Western blot結果顯示，eNOS敲除大鼠的心臟和腎臟組織中不表達eNOS蛋白。敲除大鼠的體質量明顯低于野生型大鼠，體質量增長幅度慢。血壓、收縮壓、舒張壓均高于野生型SD大鼠，有極顯著差異（P＜0.01）。eNOS敲除雌鼠心率低于野生型SD雌鼠（P＜0.05）。eNOS敲除雄鼠心率與野生型SD雄鼠相比無統計學差異。結論成功建立eNOS基因敲除大鼠模型，該模型或可成為高血壓疾病研究的理想動物模型。

內皮型一氧化氮合酶（eNOS）； 鋅指核酸酶（ZFN）； 大鼠； 基因敲除； 高血壓

高血壓是一種以動脈血壓升高為特征的復雜的多基因疾病， 是冠心病、心肌梗死、腦卒中等主要危險因素之一， 其發病率和死亡率成逐年上升的趨勢，嚴重威脅人類健康［1］。高血壓的發生與收縮血管物質分泌增多或者活性增強， 舒張血管物質分泌減少或活性減弱有關。內皮型一氧化氮合酶（eNOS）在調節血壓方面有重要作用。血管內皮細胞產生一氧化氮（NO）， 作用于血管平滑肌細胞引起血管舒張，最終導致血壓的下降。建立eNOS基因敲除大鼠模型可為高血壓的發病機制和治療的研究奠定基礎

1　材料與方法

1.1動物

SPF級SD大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK（京）2012-0001］。所有實驗用鼠飼養于中國醫科大學實驗動物部［SYXK（遼）2013-0001］，溫度為24±2 ℃，相對濕度為50%±10%自動光控（12 h明， 12 h暗）［SYXK（遼）2013-0007］。

1.2eNOS基因敲除大鼠的制備

1.2.1注射基因純化利用鋅指核酸酶（ZFN）技術構建敲除載體，酶切線性化，用Ambion公司的mMESSAGE mMACHINE?T7 ULTRA Kit進行體外轉錄然后經Qiagen公司Rnesay Mini Kit進行純化純化后的片段溶于水中，-80℃保存。注射前進行稀釋，注射濃度為10 ng/μL。

1.2.2大鼠的超數排卵和受體的準備 選用5周齡SD大鼠腹腔注射PMSG 25 IU/只， 46～48 h后腹腔注射hCG 25 IU/只， 當日與正常 SD雄鼠1∶1合籠交配，次日早晨檢查陰栓， 見栓的孕鼠做為供體鼠。超數排卵合籠的同時， 挑選野生型SD雌鼠與結扎SD雄鼠交配，次日早晨檢查陰栓， 見栓的孕鼠做為受體鼠。

1.2.3采集受精卵采用頸椎脫位法處死供體雌鼠，收集輸卵管，置于37 ℃預熱的M2培養滴中，在體視顯微鏡下撕破膨大部，獲得卵母細胞-卵丘細胞復合體，經1 mg/mL透明脂酸酶處理后得到單個受精卵，在M2中清洗3～5次后記錄受精卵數量， 轉入隔夜孵育的KSOM培養液中培養， 待注射。

1.2.4顯微注射將體外轉錄純化的編碼eNOS特異性鋅指酶的mRNA注射到大鼠受精卵中，將注射后狀態良好的受精卵移轉入CO2培養箱內孵育30 min 后進行胚胎移植。

1.2.5胚胎移植按照0.1 g/mL水合氯醛以0.31 mL/ 100 g 腹腔注射SD假孕大鼠進行麻醉，酒精消毒后剪背腎部毛，切開皮膚，在靠近輸卵管小彎處剪口，將移卵管從剪口處插入輸卵管，將受精卵吹進壺腹部，略停留片刻再拔出。將卵巢、輸卵管、子宮復位，縫合創口。

1.2.6大鼠檢測 剪取出生10～15 d的仔鼠尾部組織，在蛋白酶K作用下55℃水浴搖床過夜消化，酚氯仿法抽提鼠尾基因組DNA，設計的檢測正向引物: 5'-TGTGTTCTCTCTTCTGGCTCAGG-3'， 反向引物: 5'-CAAAGATCCTTCCAGTGCCGAAC-3'， 進行PCR反應， 條件如下: 預變性94℃ 5 min， 94 ℃ 45 s，60℃ 45 s，72 ℃ 45 s，34個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經測序、T-A克隆，確定基因缺失情況。

1.2.7純合子篩選將原代陽性鼠與野生型SD大鼠交配，產生F1代雜合子大鼠，F1代雜合子大鼠互相交配，篩選純合子大鼠。

1.3Western blot檢測

取eNOS敲除大鼠和SD野生型大鼠的心臟、腎臟組織，迅速置于液氮中，將組織粉碎，加入蛋白裂解液裂解，離心后取上清，即為總蛋白。蛋白定量、變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜，置于5%脫脂牛奶中封閉，抗體孵育，一抗為immunoway公司抗體，二抗為山羊抗兔抗體，經ECL化學檢測發光試劑發光后成像，檢測eNOS的表達情況。同時以GAPDH作為內參。

1.4eNOS基因敲除純合子大鼠外觀表型觀察

對純合子大鼠與同窩野生型大鼠頭部、軀干、四肢、尾部等進行外觀檢查， 觀察是否有畸形。

1.5組織學形態學觀察

將大鼠處死后取心、肝、脾、肺、腎、肌肉、腹主動脈血管組織， 放入0.25 g/mL多聚甲醛中固定， 進行石蠟包埋， 切片， 蘇木素-伊紅（HE）染色， 光鏡下觀察組織結構形態的改變并拍照。

1.6體質量比較

選取野生型SD大鼠雌雄各5只， eNOS敲除大鼠雌雄各5只， 測量8～16周齡的體質量， 進行比較。

1.7心率、血壓、收縮壓、舒張壓測定

選取野生型SD大鼠雌雄各5只，eNOS敲除大鼠雌雄各5只，8～9周齡。使用Softron BP-2010A儀器，采用尾套法測量大鼠心率、血壓、收縮壓、舒張壓，每只大鼠測量3次，取平均值記為該大鼠的心率、血壓、收縮壓、舒張壓。

1.8統計分析

2　結果

2.1eNOS敲除純合子大鼠基因型檢測結果

eNOS基因敲除載體體外轉錄純化后，注射到SD大鼠受精卵中，共注441枚受精卵， 存活365枚，分別移入12只SD大鼠輸卵管，共產出23只F0代大鼠。PCR產物測序分析共獲得4只陽性大鼠，選擇其中的8號大鼠進行傳代繁育篩選純合子。該基因敲除陽性大鼠第4外顯子中缺失22個堿基，導致其移碼突變（圖1）。

2.2Western blot檢測

以GAPDH作為內參成立的情況下，野生型SD大鼠心臟、腎臟表達eNOS蛋白，eNOS敲除大鼠不表達eNOS蛋白（圖2）。

2.3外觀表型觀察結果

eNOS基因敲除純合子大鼠出現肢體不同程度的缺陷（圖3）。

2.4病理學觀察

野生型SD大鼠動脈內膜內皮細胞為單層扁平狀、表面光滑，而eNOS基因敲除大鼠動脈內膜內皮細胞腫脹，表面高低不平，外膜損傷（圖4）。其他組織無明顯組織形態結構改變。

圖1　eNOS基因敲除純合子大鼠檢測結果

圖2　大鼠組織eNOS蛋白表達檢測結果

圖3　eNOS基因敲除純合子大鼠

圖4　大鼠腹主動脈血管組織病理學觀察 （HE×400）

2.5體質量比較

隨著周齡增長， 大鼠體質量平穩增加， 雄性大鼠體質量增長幅度大于雌性大鼠。eNOS敲除大鼠體質量較野生型SD大鼠輕， 體質量增長幅度慢（表1）

2.6心率、血壓、收縮壓、舒張壓測定

采用尾套法測量大鼠的血壓、心率、收縮壓舒張壓。eNOS敲除大鼠血壓、收縮壓、舒張壓均高于野生型SD大鼠（P＜0.01）。eNOS敲除雌鼠心率高于野生型SD雌鼠（P＜0.05）。eNOS敲除雄鼠心率與野生型SD雄鼠相比無差異（表2）。

表1　不同周齡大鼠體質量比較　　　　　　　　　　　　　　　　　　 g

表2　大鼠血壓、心率、舒張壓、收縮壓測定結果

3　討論

大鼠在生理、藥理和行為研究方面，尤其在某些心血管疾病、行為學研究和神經學的研究比小鼠更有意義，是理想的動物模型。大鼠在進化上比小鼠更接近于人類［2］，在一些炎癥疾病、神經系統疾病的研究中，使用大鼠作為動物模型，其表型與人類臨床表現更加接近［3-6］。例如在轉相同基因的阿爾茨海默病大、小鼠模型中，轉基因大鼠的表型與小鼠不完全相同，轉基因大鼠模型能夠有效的復制阿爾茨海默病中大腦的病理改變，其表型與人類疾病的發生更相似［7］，更適合作為阿爾茨海默病的動物模型。由于大鼠在生理、行為、代謝等方面的特點，使大鼠在生命科學研究中的作用日趨重要。一些人類疾病，如高血壓沒有很好的小鼠模型，必須依賴于大鼠模型的建立［8］。大鼠基因工程技術對大鼠模型的發展起到至關重要的作用。由于大鼠胚胎干細胞（ES細胞）培養條件的限制，基于大鼠ES細胞的傳統基因打靶技術受到很大影響，這樣使得不依賴于ES細胞的基因修飾技術顯示出巨大的優勢。近年來發展起來多種高效的研究工具，包括ZFNs技術［9］，TALENs技術［10］和CRISPR/Cas9技術［11］，提供了基因組編輯的新方法，為研究基因功能提供了新的途徑。這些技術的應用不需要ES細胞打靶階段， 其制備周期短， 效率高。本研究利用ZFN技術建立了eNOS基因敲除大鼠。該大鼠的第4外顯子中缺失22個堿基， 導致其移碼突變。對基因敲除純合子大鼠進行蛋白表達檢測發現該基因在腎臟和心臟中不表達，免疫組織化學實驗顯示同樣的結果（結果未顯示），達到了基因敲除的目的。

對eNOS基因敲除大鼠的觀察發現，純合子敲除大鼠肢體有不同程度的缺損，而雜合子大鼠外觀正常，敲除大鼠的體型小于野生型大鼠，對8～16周齡的大鼠體質量進行比較分析，敲除大鼠的體質量和體質量增長幅度明顯低于野生型大鼠。這與早期對敲除eNOS的小鼠研究結果一致，敲除eNOS的雌鼠顯示胚胎數降低， 死胎率高， 胎兒的個體更小［12，13］。基因敲除大鼠由于肢體有不同程度的缺損，對采食也會造成一定程度的影響， 從而影響了體質量的增加。eNOS是調控血管功能的關鍵，同時在調節內皮細胞的血管形成過程中也發揮著重要的作用［14，15］。本研究中對大鼠動脈的HE染色顯示， 動脈外膜明顯損傷， 對血管功能將會有一定影響。eNOS基因對肢體發育的影響在基因敲除小鼠中未見到表型，而在基因敲除大鼠中表型明顯，該基因對肢體發育的影響有待進一步研究。

在eNOS基因敲除大鼠中，血壓明顯增高，收縮壓和舒張壓也都顯著增高。在機體正常生理情況下，血管張力主要由血管收縮因子和舒張因子共同調節。NO作為體內重要的血管舒張因子，與其他的舒張因子一起介導血管的舒張反應，并可抵抗體內收縮血管的物質，如血管緊張素Ⅱ、腎素等的收縮血管作用。在大部分的血管中，內皮依賴的舒張功能主要由于eNOS來源的NO產物，eNOS下調可以引起NO大量減少，減弱了血管的舒張功能［16］。在對eNOS基因敲除小鼠的研究中顯示，eNOS基因敲除小鼠的血壓與野生型小鼠相比，血壓明顯升高［17］，在小鼠中證明了eNOS影響血壓水平。Savard等［18］研究顯示，eNOS基因轉移可加強NO的釋放，可能預防高血壓的加劇。除了血壓增加外，本研究觀察到基因敲除雌鼠的心率顯著降低，雄鼠心率沒有顯著變化。這可能是壓力感受器的反射機制對血壓升高的應答。綜上所述，本研究成功建立了eNOS基因敲除大鼠，可作為研究高血壓發病機制的理想的動物模型，同時為eNOS基因功能的研究奠定基礎。

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Establishment of eNOS Knockout Rat Model and Phenotypic Study

YANG Wei1， ZHOU Sheng-lai1， DONG Wan-wei1， WANG Wei1， YU Yang1，GUO Xiao-chong1， ZHANG E-nuo1， WANG Hong-yu2， ZHENG Zhi-hong1
（1. Laboratory Animal Center， China Medical University， Shenyang 110001， China；2. SyncBiotech Co. Ltd， Nanjing 210061， China）

ObjectiveTo establish an endothelial nitric oxide synthase （eNOS） knockout rat model.

Endothelial nitric oxide synthase （eNOS）； Zinc-finger nucleases （ZFN）； Rats； Gene knockout；Hypertension

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0271-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.002

2015-05-31

國家科技重大項目（2011ZX09307-302-02）， 遼寧省科技計劃項目（2012408002）

楊葳（1980-）， 女， 講師。E-mail: yangwei5255@sina.com

鄭志紅（1969-）， 女， 博士， 教授， 從事實驗動物轉基因與基因敲除研究。E-mail: zhihongzheng@163.com王宏宇（1974-）， 女， 博士， 從事基因編輯技術及代謝紊亂機制的研究。E-mail: xunqi@nbri-nju.com

MethodsThe encoding eNOS specific Zinc-finger nucleases （ZFN） mRNA was transcripted in vitro and purified， then injected into zygotes. The injected zygotes were transferred into oviducts of pseudopregnant rats. The genotype of knockout rats were identified by PCR and sequencing. The histopathological changes were observed by HE staining. The eNOS expression were detected by Western blot. The body weight differences were detected at 8-16 weeks ages， and the blood pressures， systokic pressures，diastolic pressures and heart rates were determined at 8 weeks age by using a tail-cuff system.

ResultTotal of441 zygotes were injected and 365 zygote cells were transplanted into oviducts of 12 recipients. Twenty-three offspring were born， and the results of PCR and sequencing showed that 4 offsprings were eNOS knockout rats. The screening result showed No.8 offspring was homozygous，and it exhibited limb defect， abnormal structures of artery. The results of Western blot showed that eNOS were not expressed in the kidney and heart in eNOS knockout rats. The comparison of body weights showed that the effect of eNOS genotype were significant different. Blood pressures， systokic pressures and diastolic pressures were higher in eNOS knockout rats than the SD rats， and there were significant differents. Heart rates were lower in the females eNOS knockout rats， but in the males eNOS knockout rats there were not significantly different. ConclusioneNOS knockout rats have been established successfully. This rat model will contribute to research of hypertension.