5-脂氧化酶轉基因小鼠表型初步研究

張梅英， 楊　葳， 吳紅聯， 2， 董婉維， 周生來， 于　洋， 王　惟， 郭曉沖， 鄭志紅

（1. 中國醫科大學實驗動物學部， 沈陽　110001； 2. 北京大學實驗動物中心， 北京　100871）

·論著·

5-脂氧化酶轉基因小鼠表型初步研究

張梅英1， 楊葳1， 吳紅聯1， 2， 董婉維1， 周生來1， 于洋1， 王惟1， 郭曉沖1， 鄭志紅1

（1. 中國醫科大學實驗動物學部， 沈陽110001； 2. 北京大學實驗動物中心， 北京100871）

目的建立5-脂氧化酶（5-LO）高表達轉基因小鼠模型，為動脈粥樣硬化（AS）發病分子機制的研究提供有應用價值的動物模型。方法對5-LO轉基因及正常對照小鼠分別選用RT-PCR、免疫組織化學、血脂、血壓監測等方法進行分析實驗。結果5-LO及大鼠5-脂氧合酶激活蛋白（FLAP）免疫組織化學實驗結果顯示，在腎和肺中5-LO及FLAP的表達，轉基因小鼠高于正常對照組小鼠； RT-PCR實驗結果顯示， 轉基因小鼠與正常對照小鼠比較在骨髓細胞、腹腔細胞、脾臟、腎臟中白三烯介質及其受體均有不同程度的高表達。其中， 兩種小鼠的腹腔細胞和骨髓細胞中白三烯A4（LTA4）、白三烯B4（LTB4）和半胱酰胺-白三烯受體2（Cys-LTR2）的表達存在差異（P＜0.05），脾和腎臟中LTB4、白三烯C4（LTC4）及Cys-LTR2的表達存在差異（P＜0.05）， 腎臟中半胱酰胺-白三烯受體1（Cys-LTR1）的表達存在差異（P＜0.05）。C反應蛋白（CRP）、白介素-1β（IL-1β）、血小板衍生因子（PDGF）、壞死因子-κB（NF-κB）等細胞因子檢測結果顯示， 在腎組織中轉基因小鼠的各項指標顯著高于正常對照小鼠（P＜0.05）； 血壓測定結果顯示， 轉基因小鼠高于正常對照小鼠（P＜0.05）； 血脂檢測結果顯示， 兩種小鼠未見明顯差異（P＞0.05）。結論成功建立5-LO高表達轉基因小鼠模型。

5-脂氧化酶（5-LO）； 動脈粥樣硬化（AS）； 轉基因小鼠

動脈粥樣硬化癥（atherosclerosis，AS）是冠心病、腦梗死等心血管疾病發生的基礎，其發病與高血脂、高血壓、內皮損傷、血栓沉積等因素均有一定關系。近年來，AS已被認為是一種慢性炎癥反應性疾?。?-4］， 并與5-脂氧化酶（5-lipoxygenase，5-LO）及其衍生物密切相關。5-LO在體內催化花生四烯酸衍生白三烯族（leukotrienes， LTs）炎性介質，5-LO作為代謝反應中的關鍵限速酶參與AS發生的炎癥反應形成過程［5］，但是高表達5-LO導致AS發生的炎癥反應機制目前并不完全清楚，為此，作者建立了高表達5-LO的轉基因小鼠模型［6］，本文擬對該模型進行相關表型分析，為5-LO過表達與AS發生發展的研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物

選擇SPF級5-LO傳代陽性轉基因小鼠及其同窩成年陰性小鼠（正常對照）進行實驗，雌雄不限［SCXK（遼）2013-0001］。飼料購自北京科澳協力飼料有限公司［SCXK（京）2013-0007］。飲用水為高壓滅菌酸化水（pH2.5～3）， 動物飼養于12 h明暗循環的屏障系統內［SYXK（遼）2013-0007］。實驗過程中對實驗用鼠均按照實驗動物的3R原則給予人道關懷。

1.2主要試劑

PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成， PCR試劑為大連寶生物工程公司產品， 組織RNA提取試劑盒為Axygen公司產品， 反轉錄試劑盒為Promega公司產品， 5-LO和5-脂氧化酶激活蛋白（FLAP）抗體為Chemicon公司產品。血脂檢測試劑盒為北京中生北控生物科技股份有限公司產品。

1.3免疫組織化學檢測

選取8周齡5-LO陽性小鼠及同窩陰性小鼠，脫頸椎快速處死動物，無菌解剖，切取肺和腎固定于質量分數4%多聚甲醛液中，組織經常規乙醇脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，石蠟包埋組織切片厚度為5 μm，切片再經二甲苯、梯度乙醇處理，檸檬酸緩沖液中100℃10 min進行抗原修復， 3%H2O2處理10 min去除內源性過氧化物酶， 5-LO（1∶500稀釋）和FLAP（1∶100稀釋）抗體濕盒中4℃下孵育過夜， DAB顯色， 蘇木素復染， 光學顯微鏡下觀察。

1.4RT-PCR檢測

選取8周齡5-LO陽性小鼠，提取骨髓細胞、腹腔細胞、脾臟、腎臟等組織總RNA并反轉錄為cDNA， 以cDNA為模板PCR擴增白三烯A4（LTA4）、白三烯B4（LTB4）、白三烯C4（LTC4）、半胱酰胺-白三烯受體1（Cys-LTR1）、半胱酰胺-白三烯受體2（Cys-LTR2）等白三烯類介質； 并以腎臟cDNA為模板， PCR擴增C反應蛋白（C-reactionprotein， CRP）、白介素-1β（IL-1β）、血小板衍生因子（PDGF）、壞死因子-κB（NF-κB）等相關細胞因子（引物序列詳見表1）。PCR反應條件均為: 95 ℃預變性5 min， 95℃變性50 s，60 ℃退火30 s， 72 ℃延伸50 s， 擴增30個循環， 72 ℃延伸10 min， PCR擴增產物經1%或2%瓊脂糖凝膠電泳后， 采用凝膠成像分析系統進行觀察。實驗均重復3次， 同時以同窩陰性小鼠為對照， 以β-actin為內參， 上述PCR反應條件擴增25個循環， 電泳結果應用ImageJ軟件進行灰度掃描并進行統計學半定量分析。

1.5血壓測定

選取8周齡 5-LO陽性小鼠及同窩陰性小鼠各10只采用美國IITC Model 229型無創血壓儀進行血壓測定， 每只動物測定均重復3次， 選取平均值。

1.6血脂檢測

選取8周齡5-LO陽性小鼠及同窩陰性小鼠各10只采用血脂檢測試劑盒進行總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白進行測定，按照試劑盒說明書進行操作。

1.7統計學分析

采用SPSS 12 統計軟件包進行統計分析，所有實驗結果以± s表示，均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1免疫組織化學檢測結果

5-LO陽性小鼠及正常對照小鼠的肺、腎臟中5-LO和FLAP蛋白免疫組織化學檢測結果見圖1和2。免疫組織化學結果顯示轉基因小鼠5-LO和FLAP表達高于正常小鼠。

表1　白三烯類介質mRNA表達檢測引物

圖1　5-LO蛋白免疫組織化學檢測（×400）

圖2　FLAP蛋白免疫組織化學檢測（×400）

2.2RT-PCR半定量分析白三烯介質（LTs）及相關細胞因子的mRNA表達結果

5-LO小鼠和正常對照小鼠的骨髓細胞、腹腔細胞、脾臟、腎臟中LTs（LTA4、LTB4、LTC4）及其受體（Cys-LTR1、Cys-LTR2）RT-PCR實驗檢測結果見圖3和圖4，實驗結果均以β-actin為內參進行比對，統計學分析顯示，5-LO小鼠的腹腔細胞和骨髓細胞中LTA4、LTB4 、Cys-LTR2 表達量顯著高于正常對照小鼠（P＜0.05）； 5-LO小鼠的脾、腎臟中LTB4、LTC4、Cys-LTR2表達量顯著高于正常對照小鼠（P＜0.05）； 5-LO 小鼠的Cys-LTR1只在腎臟中表達高于與正常對照小鼠（P＜0.05）。另外， 5-LO小鼠腎臟中CRP、IL-1β、PDGF、NF-κB等細胞因子RT-PCR檢測結果見圖5，實驗結果以β-actin為內參進行比對，統計學分析顯示，5-LO小鼠腎中的CRP、IL-1β、PDGF、NF-κB表達量均高于與正常對照小鼠（P＜0.05）。

2.3血壓檢測

5-LO小鼠及正常對照小鼠血壓分別為91.75± 1.25 mmHg和102.5±1.0 mmHg（P＜0.05）。

2.4血脂檢測

圖3　白三烯介質RT-PCR檢測

圖4　白三烯受體RT-PCR檢測

圖5　細胞相關因子檢測

5-LO小鼠及正常對照小鼠總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白各項指標檢測結果詳見表2，兩組動物各項血脂指標比較無統計學差異（P＞0.05）。

表2　小鼠血脂檢測　　　　 mmol/L

3　討論

AS發生是一個慢性反應性疾病過程，屬于復雜疾病范疇，其發病由多因素導致，其中炎癥反應對AS的發生起到關鍵作用。5-LO作為生物機體炎癥反應過程的中樞酶，特定引導白三烯家族炎性因子的生物合成通路［5］， 其下游產物LTB4、LTC4、LTD4及白三烯E4（LTE4）等一系列炎性因子作為炎癥反應的重要介質，影響動脈粥樣硬化發生、發展及斑塊的穩定性［7］。為此，作者建立了5-LO過表達的轉基因小鼠［6］，以期在動物整體水平上觀察研究5-LO蛋白過表達與AS發生發展的相互關系。

5-LO主要在巨噬細胞、單核細胞、肥大細胞、樹突狀細胞中表達，同時巨噬細胞、T細胞、肥大細胞、平滑肌細胞及血管內皮細胞表達白三烯細胞膜受體，白三烯分子與其受體在這些細胞表面以自分泌和旁分泌的形式相互作用，導致AS炎癥在血管內壁上的發生和發展［5］。5-LO轉基因小鼠在前期RNA和蛋白水平實驗中均檢測到5-LO及其激活蛋白FLAP的高表達［6］， 本實驗中肺和腎臟組織的5-LO及其激活蛋白FLAP免疫組織化學檢測結果顯示， 5-LO在轉基因小鼠表達明顯高于正常小鼠，組織學水平實驗進一步證實外源目的蛋白在體內穩定表達。5-LO下游產物LTA4、LTB4、LTC4等白三烯介質檢測顯示其在腹腔細胞、骨髓、脾和腎臟中均有不同程度的表達， 其中LTA4屬于5-LO信號途徑早期的中間代謝產物， RT-PCR實驗中也顯示5-LO轉基因小鼠骨髓細胞中LTA4高表達（P＜0.05）；LTB4為LTA4其中一條代謝途徑的產物，是一種有效的中性粒細胞化學誘導物，它能改變血管通透性，可使白細胞黏附于內皮細胞，在腹腔細胞和血管叢密集的臟器中高表達，對于血管內斑塊形成發展發揮重要的作用， 本實驗5-LO小鼠腹腔細胞和腎臟中LTB4表達顯著高于正常對照小鼠（P＜0.05）LTA4的另一條代謝途徑是受特異的谷胱甘肽硫轉移酶催化生成LTC4，再經谷氨酰轉肽酶和二肽酶催化生成LTD4和LTE4，他們能刺激平滑肌收縮并能改變血管通透性，本實驗脾和腎組織中LTC4表達檢測結果均與之相符（P＜0.05）。Cys-LTR1 Cys-LTR2等CysLTs的受體在腎組織中表達均明顯高于正常小鼠。以上結果均提示5-LO轉基因小鼠體內外源目的蛋白的高表達已經啟動5-LO通路下游產物的生物合成。

CRP、IL-1β、PDGF、NF-κB等是體內參與免疫應答、炎癥反應的細胞因子， 其中CRP、IL-1β均與NF-κB調控相關，CRP水平與炎癥的出現及其嚴重程度密切相關［8］， NF-κB 、PDGF、 IL-1β均不同程度參與動脈粥樣硬化進程［9，10］。本實驗中，在5-LO小鼠腎組織中RT-PCR檢測到CRP PDGF和NF-κB等細胞因子的表達高于正常小鼠（P＜0.05），提示5-LO小鼠體內已經存在炎癥反應高發風險。在血脂和血壓檢測中，血脂未見明顯的差異（P＞0.05），但是5-LO小鼠LDL-C檢測值低于正常小鼠，總膽固醇檢測值二者相似，與理論預期不符，分析原因可能與動物個體差異和實驗操作有一定關系，有待于今后進一步的實驗驗證； 血壓檢測結果顯示5-LO小鼠高于正常小鼠（P＜0.05）但均在小鼠正常血壓范圍。

綜上所述， 5-LO轉基因小鼠已經具有高發炎癥反應風險，本研究將為探索動脈粥樣硬化炎癥反應機制實驗研究打下基礎。

［1］Merched AJ， Ko K， Gotlinger KH， et al. Atherosclerosis evidence for impairment of resolution of vascular inflamma tion governed by specific lipid mediators［J］. FASEB J， 2008 22（10）:3595-3606.

［2］Cipollone F， Mezzetti A， Fazia ML， et al. Association between 5- lipoxygenase expression and plaque instability in human ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2005， 25:1665-1670.

［3］ Kriszbacher I， Koppán M， Bódis J. Inflammation atherosclerosis， and coronary artery disease ［J］. N Engl Med， 2005， 353（4）:429-430.

［4］李玉潔， 楊慶， 翁小剛， 等. 動脈粥樣硬化炎癥信號通路研究進展［J］. 中國藥理學通報， 2009， 25（7）:857-860.

［5］Lotzer K， Funk CD，Habenicht AJ. The 5-lipoxygenase pathway in arterial wall biology and atherosclerosis［J］. Biochem Biophys Acta， 2005， 1736（1）:30-37.

［6］張梅英， 吳紅聯， 楊葳， 等. 5-脂氧化酶轉基因小鼠模型的制備［J］. 中國實驗動物學報， 2010， 18（1）:60-64.

［7］Jawien J，Korbut R. The current view on the role of leukotrienes in atherogenesis［J］. J Physiol Pharmacol， 2010， 61（6）:647-650.

［8］梅衛義， 杜志民， 胡承恒， 等. 妊娠相關血漿蛋白A水平與不穩定心絞痛患者冠狀動脈狹窄病變形態的關系［J］. 中山大學學報: 醫學科學版， 2005， 24（4）:456-458.

［9］Andrae J， Dallini R， Betsholtz C. Role of platelet derived growth factors in physiology and medicine［J］. Gene Dev，2008， 22（10）:1276-1312.

［10］ Brand K， Page S， Rogler G， et al. Activated transcription factor nuclear factor-kappa B is present in the atherosclerotic lesion ［J］. J Clin Invest， 1996， 97（7）:1715-1722.

A Preliminary Study on Phenotype of 5-Lipoxygenase Transgenic Mice

ZHANG Mei-ying1， YANG Wei1， WU Hong-lian1，2， DONG Wan-wei1， ZHOU Sheng-lai1，YU Yang1， WANG Wei1， GUO Xiao-chong1， ZHENG Zhi-hong1
（1. Laboratory Animal Center， China Medical University， Shenyang 110001， China；2. Laboratory Animal Center， Peking University， Beijing 100871， China）

ObjectiveTo establishment a 5-lipoxygenase （5-LO） transgenic mouse model， which may be used for the research of the pathogenesis of atherosclerosis. MethodsRT-PCR and immunohistichemistry was used to detect 5-LO transgenic mice and control mice. The cholesterol and blood pressure was also detected. ResultExpression of 5-LO and 5-lipoxygenase activating protein （LFAP） were higher in the kidney and lung of the 5-LO transgenic mice than the control mice. The results of RT-PCR showed that the expression of leukotriene and its receptor were higher in the bone marrow cells， peritoneal cells， spleen and kidney of the 5-LO transgenic mice than the control mice. Compared the 5-LO transgenic mice with the control mice， there were significant differences in the expression of LTA4， LTB4 and Cys-LTR2 in the bone marrow cells and peritoneal cells （P＜0.05）， there were significant differences in the expression of LTB4， LTC4 and Cys-LTR2 in the spleen and kidney （P＜0.05），there was a significant difference in the expression of Cys-LTR1 in the kidney （P＜0.05）， there were significant differences in the expression of CRP， IL-1β， PDGF and NF-κB in the kidney （P＜0.05）. The result of blood pressure determination showed that it was higher in the 5-LO transgenic mice than the control mice （P＜0.05）， and there was no significance in the cholesterol （P＞0.05）. ConclusionThe 5-LO transgenic mouse model has been established.

5-lipoxygenase（5-LO）； Atherosclerosis； Transgenic mice

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0265-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.001

2015-05-31

遼寧省高校科研項目計劃（2008S239）； 遼寧省科技計劃項目（2008408002-2， 2014408001）

張梅英（1965-）， 女， 研究方向: 實驗動物轉基因。E-mail: zhmeiying@163.com

鄭志紅。E-mail: zhihongzheng@163.com