Notch信號促進核因子κB受體活化因子配體誘導的破骨細胞分化的體外研究

何飛 吳勇 周艷

深圳市人民醫院口腔科，深圳 518020

破骨細胞分化的激活和功能亢進是導致牙周病牙槽骨吸收的關鍵環節。研究破骨細胞分化的信號調控，可以進一步了解牙周病骨吸收原理；阻斷破骨細胞分化信號通路，也可能成為防止牙周病牙槽骨吸收的有效策略。已有的研究[1-4]顯示， Notch信號是破骨細胞分化調控的關鍵信號之一，但其具體作用尚存在不同意見。本研究旨在初步探討Notch信號在體外破骨前體細胞RAW264.7分化中的作用，為進一步明確其作用的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞株（ATCC），DMEM、特級胎牛血清（Gibco公司，美國），鼠重組細胞核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）（Peprotech公司，美國），γ分泌酶抑制劑（γ-secretase inhibitor，GSI）（L685，458，Calbiochem公司，美國），破骨細胞分化標志物抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphase，TRAP）染色試劑盒（Sigma公司，美國）。

1.2 破骨細胞分化誘導

將RAW264.7細胞復蘇后應用高糖DMEM進行培養，每隔3 d細胞換液1次，細胞鋪滿即可進行傳代。為檢測Notch信號抑制對RANKL誘導的破骨細胞分化的影響，本研究將不同濃度GSI與RANKL共同加入培養液。將細胞分為3組：陰性對照組（即空白對照組），RANKL誘導組（50 ng·mL-1），RANKL（50 ng·mL-1）+GSI（1、2、5 μmol·L-1）組。

1.3 實時定量聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）

采用TRIzol試劑一步法抽提RAW264.7細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA260 nm/RNA280 nm光密度值以檢測RNA樣品的純度和濃度；然后按FERMENTAS逆轉錄試劑盒標明的操作步驟進行real-time PCR，cDNA合成42 ℃ 60 min，70 ℃滅活5 min。用SYBR GREEN試劑盒進行real-time PCR分析。利用Primer Express 2.0設計針對基因與內參照β-actin的引物，具體如下。Notch1正義鏈 5’-TGTGACAGCCAGTGCAACTC-3’，反義鏈 5’-TGGCACTCTGGAAGCACTGC-3’；Notch2正義鏈5’-CCCCTTGCCCTCTATGTACCA-3’，反義鏈5’-GGTAGGTGGGAAAGCCACACT- 3’；Delta1正義鏈 5’-ACCTTCTTTCGCGTATGCCTCAAG-3’，反義鏈5’-AGAGTCTGTATGGAGGGCTTC-3’；Jagged1正義鏈5’-ATTCGATCTACATAGCCTGTGAG-3’，反義鏈5’-CTATACGATGTATTCCATC-3’；Hes1正義鏈5’-GCCAGTGTCAACACGACACCGG-3’，反義鏈 5’-TCACCTCGTTCATGCACTCG-3’；TRAP正義鏈 5’-GCAAGGTCCCCAACGGCTATC -3’，反義鏈5’-GCCTCGGCAGCCTGGTCT-3’；Cathepsin K正義鏈5’-AAGAGGTGGTTCAGAAGATG-3’，反義鏈5’-TATTGGAAGGCATTGGTCAT-3’；β-actin正義鏈5’-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3’，反義鏈5’-CTCTTTGATGTCACGCACGCACGATTTC-3’。

PCR反應體系均為20 μL，反應液各成分分別為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，DNA模板2.0 μL，dH2O6.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL。每組設陰性對照，每組3個復孔。反應條件：95 ℃ 30 s，1個循環；95 ℃ 5 s，58 ℃ 34 s，40個循環。反應體系于ABI 7500 real-time PCR儀上進行檢測，自動掃描并記錄熒光強度。通過調整模板濃度使內參β-actin擴增Ct值為18～30。應用ABI 7500 System SDS Software1.3.1軟件進行數據處理，其相對表達量采用2－ΔΔCt方法計算。

1.4 TRAP染色及TRAP陽性細胞計數

將RAW264.7細胞接種于24孔板中，按上述分組培養，結束后棄去培養基，PBS洗滌2次，4%甲醛固定液室溫固定10 min，PBS洗2次，甲醇和丙酮混合液（體積比1∶1）固定3～5 min，PBS洗2次，37 ℃條件下用TRAP染色液染色30 min，雙蒸水洗3次，光鏡觀察并進行TRAP陽性細胞計數。細胞核數目≥3個且TRAP染色陽性的細胞視為破骨細胞。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件包進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RANKL誘導下破骨細胞分化

RAW264.7細胞正常生長呈圓形、梭形或橢圓形（圖1）。經50 ng·mL-1RANKL誘導后，部分細胞體積增大，形狀不規則，可見裙狀、放射狀或絲狀偽足伸出，胞核數目增多（細胞核≥3個），TRAP染色細胞質內可見玫瑰紅色顆粒（圖2），此細胞可視為破骨細胞。

圖1 正常RAW264.7細胞的形態觀察 倒置相差顯微鏡 × 100Fig 1 Observation of normal RAW264.7 cells inverted phase contrast microscope × 100

2.2 破骨細胞分化中Notch信號成分及破骨細胞標志基因mRNA的表達

50 ng·mL-1RANKL誘導RAW264.7細胞3 d，RANKL誘導組Notch1、Notch2、Delta1、Jagged1、Hes1、TRAP、Cathepsin K的相對表達量分別為1.054±0.435、3.625±0.586、1.261±0.361、3.813±0.476、1.932±0.273、8.752±0.982、1.983±0.364。與空白對照組相比，Notch受體Notch1、Notch2，配體Delta1、Jagged1及靶基因Hes1 mRNA表達水平均有不同程度的提高，其中Notch2、Jagged1表達增高最顯著（P<0.05）；同時破骨細胞標志基因TRAP及Cathepsin K的表達顯著增高（P<0.05）。提示RANKL可促進Notch信號，參與破骨細胞分化過程，其中Notch2、Jagged1可能是主要發揮作用的受-配體。

圖2 破骨細胞的形態觀察 TRAP染色 × 100Fig 2 Observation of the osteoclasts TRAP staining × 100

2.3 Notch信號抑制對RAW264.7細胞分化的影響

經檢測，GSI抑制Notch受體表達可致下游靶基因Hes1表達降低（圖3）。空白對照組，RANKL誘導組，RANKL+GSI（1、2、5 μmol·L-1）組TRAP陽性細胞計數分別為5.2±1.3、125.6±12.7、94.5±10.8、70.3±8.9、37.5±5.2。與RANKL誘導組相比，加入GSI各組TRAP陽性細胞計數顯著減少，且呈劑量依賴性（P<0.05）。

圖3 PCR檢測Hes1 mRNA的表達Fig 3 The expression level of Hes1 mRNA analyzed by PCR

3 討論

Notch信號是調控細胞增殖和分化最重要的保守性信號途徑之一，在多種細胞的增殖和分化的調控中起關鍵作用[5-7]。破骨細胞作為牙周病骨吸收及牙槽骨改建的主要功能細胞，其分化同樣受到Notch信號的調控[1-4]。本研究顯示，RANKL誘導后小鼠RAW264.7細胞多種Notch信號成分及下游靶基因表達增強；以GSI抑制Notch受體的表達，其下游靶基因表達同步降低，同時RAW267.4細胞分化為多核破骨細胞的數量明顯減少。提示Notch信號可能促進破骨細胞的分化。與本研究相似，國內外學者[1-2]通過對RAW264.7細胞及小鼠骨髓巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）的研究，認為Notch2信號具有促進破骨細胞分化的作用。但有研究[3]顯示，當BMMs的Notch1、Notch2、Notch3基因受到抑制時，其向破骨細胞分化能力加強；同樣的，Yamada等[8]研究發現Notch1-Delta1信號不但抑制破骨前體細胞自身分化，同時促進骨髓基質細胞RANKL/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）的表達，抑制M-CSF的表達，進一步抑制破骨細胞的分化。

分析各研究結果產生差異的原因，一方面可能與各研究所用的細胞種類及細胞所處的狀態不同有關。Notch信號是存在于細胞表面的信號分子，它的功能的實現依賴于細胞所處的微環境，從而導致細胞對外界刺激的反應不同[5]。另一方面，有研究[9]表明，Notch信號的不同受-配體組合在同一細胞中可能發揮不同的作用。本研究發現，RAW264.7細胞中各Notch受-配體表達水平不同，RANKL誘導后表達變化也不同，其中以Notch2和Jagged1的本體表達及增強變化最為顯著，推測Notch2-Jagged1可能是Notch信號參與RAW264.7細胞向破骨細胞分化的主要受-配體對。不同Notch受-配體在破骨細胞分化中的關系及具體作用機制都值得進一步研究。

破骨細胞來源于骨髓單核/巨噬細胞系，其分化過程受多種信號通路的調節。其中RANKL是調控其分化的關鍵因子[10]。多種因子通過與RANKL通路直接或間接的相互作用實現對破骨細胞分化的調控。已有研究[8]發現，Notch可通過對成骨細胞/骨髓基質細胞中RANKL/OPG表達的調節影響破骨細胞的分化。另外，Notch信號與核因子κB信號間存在交互應答關系[11-12]。核因子κB作為分布廣泛、且具有眾多下游靶基因的轉錄因子，與存在于靶基因上游調控區中的輔激活因子的特定組合是基因表達調控的重要模式之一。因此，進一步對破骨細胞分化中Notch與其他信號間交互作用的研究，為更好的了解骨吸收原理提供更多的實驗依據。

[1]Fukushima H, Nakao A, Okamoto F, et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis[J]. Mol Cell Biol, 2008, 28(20):6402-6412.

[2]段莉, 賀鵬, 鄭根建. 活化Notch2信號促進高糖條件下破骨細胞分化的體外研究[J]. 華西口腔醫學雜志, 2012, 30(6):589-593.

[3]Canalis E, Adams DJ, Boskey A, et al. Notch signaling in osteocytes differentially regulates cancellous and cortical bone remodeling[J]. J Biol Chem, 2013, 288(35):25614-25625.

[4]Bai S, Kopan R, Zou W, et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells[J]. J Biol Chem, 2008, 283(10):6509-6518.

[5]Hori K, Sen A, Artavanis-Tsakonas S. Notch signaling at a glance[J]. J Cell Sci, 2013, 126(Pt 10):2135-2140.

[6]Artavanis-Tsakonas S, Muskavitch MA. Notch: the past,the present, and the future[J]. Curr Top Dev Biol, 2010, 92:1-29.

[7]Varnum-Finney B, Xu L, Brashem-Stein C, et al. Pluripotent, cytokine-dependent, hematopoietic stem cells are immortalized by constitutive Notch1 signaling[J]. Nat Med,2000, 6(11):1278-1281.

[8]Yamada T, Yamazaki H, Yamane T, et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells[J]. Blood, 2003,101(6):2227-2234.

[9]Jaleco AC, Neves H, Hooijberg E, et al. Differential effects of Notch ligands Delta-1 and Jagged-1 in human lymphoid differentiation[J]. J Exp Med, 2001, 194(7):991-1002.

[10]Li J, Sarosi I, Yan XQ, et al. RANK is the intrinsic hematopoietic cell surface receptor that controls osteoclastogenesis and regulation of bone mass and calcium metabolism[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(4):1566-1571.

[11]Cheng P, Zlobin A, Volgina V, et al. Notch-1 regulates NF-kappa B activity in hemopoietic progenitor cells[J]. J Immunol, 2001, 167(8):4458-4467.

[12]Espinosa L, Inglés-Esteve J, Robert-Moreno A, et al. Ikappa-Balpha and p65 regulate the cytoplasmic shuttling of nuclear corepressors: cross-talk between Notch and NF kappa B pathways[J]. Mol Biol Cell, 2003, 14(2):491-502.