自噬及其與腫瘤生長、侵襲、治療的關系

史善偉 李一

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院頭頸腫瘤外科（四川大學），成都 610041

自噬（autophagy）是真核細胞中一種高度保守的細胞生物學行為，是細胞的自體吞噬、消化的過程，其中細胞通過雙層膜結構包裹細胞內的胞漿和小細胞器，并運送到溶酶體中進行代謝，為細胞提供營養物質和能量，維持細胞的代謝平衡，緩解應激壓力[1]。自噬可被分為基礎狀態下的自噬和誘導狀態下的自噬，基礎狀態下的自噬代謝速率較低，主要通過清除有聚集傾向的蛋白質和損傷的細胞器來維持細胞內環境的穩態[2]。在低氧、營養匱乏等不利微環境的誘導下，細胞通過激活、上調自噬水平來降解細胞內蛋白聚集體、氧化脂質、受損細胞器等物質來維持細胞存活[3]。

自噬是一種復雜的生理現象，根據底物進入溶酶體的途徑不同可分為三種類型：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediate autophagy，CMA）。巨自噬（通常簡稱為自噬）是細胞內大分子物質和小細胞器被運送到溶酶體進行降解的過程。在這個過程中，內質網和高爾基體膜被拉長，并包裹周圍的細胞質或特定物質形成雙層膜結構，即自噬體（autophagosome）。自噬體隨后與溶酶體融合形成自噬溶酶體（autolysosome），其內包裹的物質被溶酶體內水解酶分解代謝，形成小分子物質（如氨基酸、核苷酸等）又被細胞重新利用[4]。微自噬是溶酶體膜隨機內陷包裹周圍細胞質的一種非選擇性的溶酶體降解過程[5]。分子伴侶介導的自噬僅存在于哺乳動物中，是細胞內的分子伴侶蛋白，如熱休克蛋白70（heat shock cognate protein 70，HSC70），與有特定序列的可溶性蛋白底物結合，最后被運送到溶酶體內降解的過程，該過程具有一定的選擇性[6]。本文主要就巨自噬這一細胞內主要的自噬類型與惡性腫瘤的發生過程進行探討。

1 調控自噬的信號通路

1.1 Beclin 1

哺乳動物的Beclin 1與酵母菌Atg6/Vps30是同源基因，其編碼的Beclin 1蛋白對自噬的調控具有重要的作用。Beclin 1與多種因子（Atg14L，UVRAG，Bif-1，Rubicon，Ambra1，HMGB1，nPIST，VMP1，SLAM，IP3R，PINK）共同作用來調節脂質激酶Vps34蛋白，促進Beclin 1-Vps34-Vps15核心復合物的形成，從而影響細胞的自噬活性[7]。在這一過程中，Ⅲ類PI3K激酶復合物是調節作用的核心調控因子，其包括Vps34/PI3KC3催化亞基、Vps15/PI3KR4調節亞基和Beclin 1、UVRAG、Atg14L、Rubicon蛋白[8]。其中Atg14L與Beclin 1的CCD結構域結合形成的Beclin 1-PI3KC3復合體能激活Vps34，從而使LC3蛋白聚集和吞噬泡膜延長，促進自噬體的形成。紫外線放射抵抗蛋白（ultraviolet radiation resistance-associated gene protein，UVRAG）與Beclin 1的CCD結構域結合形成的Beclin 1-PI3KC3-UVRAG復合體可以激活Ⅲ類PI3K激酶復合物的活性，促進自噬體的成熟。而Rubicon作為UVRAG的亞單位與Beclin 1結合，反而能抑制自噬體的成熟[9]。通過酵母菌的雙雜交系統，研究者發現Beclin 1蛋白的BH3結構域可與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-W、Bcl-XL相互作用。在乳腺癌中，Bcl-2的過度表達能抑制癌細胞的凋亡，Bcl-2也能通過與Beclin 1的BH3結構域結合來抑制Beclin 1-Vps34復合物的形成，從而削弱了Ⅲ類PI3K的作用，抑制細胞的自噬活性[10]。在營養缺乏的條件下，Beclin 1與Bcl-2或Bcl-XL的結合受到抑制，可以激活細胞自噬活性。因此，Beclin 1與不同的蛋白分子結合對自噬體的形成和成熟產生不同的作用。

1.2 雷帕霉素受體

雷帕霉素受體（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在癌細胞中起下調自噬的作用。mTOR可以與多種蛋白質結合形成兩種不同的復合物：雷帕霉素受體復合物1（mTORC1）和雷帕霉素受體復合物2（mTORC2），其中mTORC1在細胞自噬的負調節中起主要作用。在調節mTORC1的三條信號通路中，Ras原癌基因通路和Ⅰ類PI3K-AKT通路具有激活mTORC1的作用，而肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）、AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）則有抑制mTORC1的作用[11]。腫瘤細胞中的抑制基因PTEN常發生突變或缺失，PTEN基因的突變或缺失可引起AKT的激活，AKT能夠通過磷酸化TSC2激活mTORC1的結合蛋白PRAS40，使其與mTORC 1解離從而激活mTORC1[12]。研究發現，生長因子可以激活Ⅰ類PI3K復合體和GTPase Ras，從而激活Ⅰ類PI3K-AKT通路，致使TSC1/TSC2磷酸化來激活mTORC1[13]。在低氧、營養匱乏等應激條件下，細胞內ATP水平降低而AMP/ATP的比值升高，從而激活抑癌基因LKB1，導致AMPK活化，AMPK激活可以通過磷酸化TSC2來抑制GTPase Rheb，并下調mTORC1的功能[11]。腫瘤抑制基因p53突變也可以通過激活AMPK來抑制mTORC1的活性。在mTORC1的下游調節通路中，mTORC1的激活能促進哺乳動物自噬相關蛋白13（mammalian autophagy related protein 13，mAtg13）與ULK的結合，并通過磷酸化ULK1復合體來抑制自噬體的形成，從而抑制自噬活性[14]。

2 自噬的測量

真核生物細胞中自噬的檢測和定量分析對研究自噬對真核生物生長發育的影響和自噬與疾病的關系有重要作用。目前，對自噬體的測量主要有三種方法：電鏡觀察、Western免疫印跡技術和LC3免疫熒光顯微鏡技術。自噬體在超微結構下被定義為包含未被消化的細胞質或小細胞器（如線粒體，部分內質網），且未與溶酶體融合的雙層膜結構。利用電鏡觀察自噬體的結構可以對自噬體從早期到晚期的體積進行定性或定量測量[13]。細胞自噬是一個動態過程，對自噬體數量的測量只能描述自噬過程中的某一靜態瞬間，而不能反映其整體的動態活性。基于這一缺陷，自噬潮（autophagic flux）這一概念被引入，用于描述自噬活性，其是指底物被自噬體包裹后運送到溶酶體內降解并重新利用的整個過程，主要通過微管相關蛋白1的輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3）在不同條件下的濃度變化進行描述。在自噬過程中，LC3首先切除C端的氨基酸轉化成為散布于胞漿內的LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ再與磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）結合形成穩定存在于自噬體內膜和外膜上的LC3-Ⅱ從而在細胞自噬的整個過程中發揮重要的調控作用[15]。LC3是哺乳動物細胞中酵母Atg8基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡表面，在哺乳動物自噬泡形成過程中，LC3在協同由Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12參與組成的泛素樣蛋白加工修飾過程中起重要作用，其表達和LC3-Ⅰ至LC3-Ⅱ的轉化程度成為自噬水平的重要標志[16]。因此，免疫熒光蛋白LC3（green fluorescent protein- LC3，GFPLC3）可以作為細胞內檢測自噬體的特異標記物。細胞中LC3水平升高可能是由于自噬活性的增加導致，也可能是由于自噬體在后期降解過程被阻滯導致，因此單純在某一時間點測量細胞在特定藥物作用下的LC3含量并不能準確反映細胞的自噬活性。實驗中通常需要測量細胞基礎自噬與自噬阻滯條件下的LC3含量差別來準確反映細胞自噬的動態活性。廣泛使用的自噬抑制劑是氯喹（Chloroquine）、巴弗洛霉素A1（Baf ilomycin A1）或溶酶體蛋白酶等，通過阻斷自噬體與溶酶體的融合，導致自噬體的積累[17]。利用蛋白免疫印跡技術和免疫熒光顯微鏡技術檢測目標細胞與正常細胞基礎水平下LC3的含量，可以反映細胞的自噬活性，對誘導狀態下自噬潮的測量可反映出細胞的自噬潛力。近年來，除了LC3，p62蛋白檢測亦被用于自噬水平評價中。p62/SQSTM1是一種多功能蛋白，參與多種信號傳導通路（包括凋亡和細胞自噬），其包含與LC3蛋白結合的結構域，二者的結合物進入自噬溶酶后被降解，如果自噬被抑制，SQSTM1水平則上升。p62/SQSTM1的水平與基礎自噬水平成負相關關系，可以利用細胞免疫組織化學、染色、蛋白免疫印跡法和GFP標記方法對p62進行連續測量來反映自噬的活性[18]。

3 自噬與腫瘤

自噬在腫瘤發生、發展、轉移的過程中具有“雙刃劍”的作用。首先，在腫瘤發生的前期，自噬可以通過清除正常細胞內受損線粒體、過氧化物酶體及其他細胞毒性物質來維持細胞內穩態，抑制癌基因的激活，防止腫瘤的發生[4]。其次，在已經惡性轉化的癌細胞中，自噬通過再循環作用，為癌細胞的生存提供營養物質，從而維持癌細胞的存活，并能促進惡性腫瘤的增殖和侵襲轉移[19]。

3.1 自噬對腫瘤的抑制作用

在哺乳動物體內，病原體和細胞毒性物質的刺激可以使機體產生慢性炎性損傷，而慢性炎癥環境又可以激活癌基因，導致腫瘤發生[20]。Beclin 1等位基因缺失能引起p62的積累并抑制核轉錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，從而引起細胞壞死，并能使Kupffer巨噬細胞聚集，引發炎癥反應，最終導致腫瘤的發生[21]。細胞內的自噬作用可以清除過量積累的p62，防止細胞壞死引起的炎癥，從而預防腫瘤的發生。在應激條件下，細胞內線粒體損傷，可導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累，造成DNA損傷[22]。自噬既能清除細胞內損傷的線粒體，防止ROS的積累，維持染色體的穩定；又能夠通過分解代謝作用為DNA修復提供必需的核苷酸[2]。因此，自噬可以通過維持細胞內染色體的穩定，防止癌基因激活，預防腫瘤的發生。自噬也能促進機體的免疫應答反應，清除腫瘤相關病毒和腫瘤細胞，從而達到對腫瘤的抑制作用。研究發現，抗原呈遞細胞中的自噬反應能夠影響多種細胞因子的釋放，從而在細胞死亡之前激活免疫應答反應；同時，自噬也能激活骨髓淋巴細胞并維持骨髓淋巴細胞的存活，因此，自噬在先天性免疫應答反應中具有重要的作用[23]。從免疫學角度，腫瘤細胞必須通過失去抗原特性或者抑制免疫應答反應來逃避免疫監控從而得以存活，腫瘤細胞的自噬可以激活并增強MHCⅠ類和Ⅱ類分子對抗原的呈遞和對CD4+T細胞的活化，增強細胞的免疫應答反應，從而增強機體清除腫瘤細胞的能力，預防腫瘤的發生[24]。綜上所述，自噬能通過抑制機體內的炎癥反應，維持染色體穩定和促進機體免疫應答反應等途徑來抑制腫瘤的發生。

3.2 自噬對腫瘤的促進作用

3.2.1 自噬有利于腫瘤細胞的存活和增殖 腫瘤微環境主要由癌細胞、非惡性上皮細胞、成纖維細胞、血管、免疫細胞和細胞外基質等組成，這些因素相互作用，對腫瘤的發生、增殖和轉移具有重要的作用。自噬作為腫瘤細胞生存的重要機制，可以在腫瘤細胞和腫瘤微環境之間起調節作用。研究發現，在低氧和營養缺乏的環境下，肝腫瘤干細胞CD133+細胞能夠通過激活自噬來維持細胞存活[25]。缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factors，HIF）-1α和-2α是細胞適應低氧環境的主要轉錄調節因子。在低氧情況下，HIF因子激活編碼葡萄糖轉運和糖酵解酶基因的轉錄，而后者能抑制Bcl-2和Beclin 1的結合，促進Beclin 1激活細胞的自噬來清除損傷線粒體，減少ROS產生[26]。

腫瘤細胞通過自噬分解代謝作用產生營養物質和能量來維持腫瘤細胞的生存，并緩解外界環境對腫瘤細胞的應激壓力。自噬最初是在酵母菌應對饑餓時發現的，酵母菌通過自噬維持氨基酸水平和上調線粒體功能來支持饑餓條件下酵母細胞的存活[27]。自噬在低氧區域的腫瘤細胞中非常突出，如果敲除重要的自噬相關基因，可導致低氧區域的腫瘤細胞發生死亡[28]。此外，Ras致癌基因的活化，可誘發腫瘤的生長，這些腫瘤細胞通過上調自噬水平來提高在應激環境下的生存能力[29]。研究發現，雄激素可以通過上調自噬，增加前列腺腫瘤細胞內的脂質水平來促進前列腺癌細胞的生長[30]。線粒體是細胞內氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要場所，并為細胞的生命活動提供能量，自噬作用可以使腫瘤細胞在低氧等應激條件下保持線粒體的功能，從而為腫瘤細胞的增殖提供充足的能量。

3.2.2 自噬有利于細胞的侵襲、轉移 腫瘤休眠是惡性腫瘤細胞的生物特性之一。腫瘤細胞的休眠作用一方面可以使腫瘤逃避手術和放療的打擊，在休眠細胞重新激活增殖后導致腫瘤復發，另一方面也可以保持腫瘤轉移時的細胞活性[31]。自噬能使休眠的腫瘤細胞抵抗細胞凋亡，對其生存有重要的保護作用。乳腺癌細胞向骨髓轉移時，癌細胞會在骨髓中以休眠的形式存活一段時間，而骨髓微環境中有大量腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL），TRAIL可以通過T細胞和NK細胞介導腫瘤細胞凋亡來抑制腫瘤的轉移，最近研究發現，腫瘤細胞中自噬水平的上調可以抑制TRAIL，從而保護休眠的腫瘤細胞[32]。在卵巢癌和消化道間質瘤的轉移腫瘤細胞中，腫瘤抑制基因ARHⅠ（aplasia ras homolog member Ⅰ）能激活自噬，并促進腫瘤細胞休眠，但如果ARHⅠ的表達水平下降，休眠的腫瘤細胞就會恢復增殖潛能并迅速生長[33]。如果抑制ARHⅠ介導的自噬，則能顯著降低種植轉移腫瘤細胞的再生長，從而證明，自噬對休眠細胞的存活和再生長具有重要作用[34]。

正常細胞與細胞外基質失去接觸會誘發細胞的程序性死亡，即失巢凋亡。細胞的失巢凋亡能維持機體的生長發育和自身平衡，如小鼠可以通過這一過程清除其乳腺導管形成過程中基底膜上脫落的上皮細胞[35]。腫瘤細胞通過特殊的蛋白質附著于宿主細胞或細胞外基質上以保持其生理活性，在向遠處轉移的過程中必須激活抗失巢凋亡機制來維持細胞的存活。腫瘤細胞在脫離細胞外基質后，β1整合素信號通路受到破壞，而細胞脫離細胞外基質或β1整合素信號通路阻滯均可激活細胞自噬[36]。自噬可以使脫離細胞外基質的腫瘤細胞通過重新代謝作用為自身提供營養物質以維持其生存。在腫瘤細胞轉移過程中，自噬可以保護腫瘤細胞通過脈管系統，并在遠處附著生存[37]。自噬對失巢凋亡的抑制作用可以使惡性腫瘤細胞在侵襲轉移過程中存活下來，并使腫瘤細胞在宿主細胞或細胞外基質環境中得以生存。但自噬的抗失巢凋亡機制尚不清楚。

上皮—間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞經過特定程序促使其黏附分子表達減少，細胞骨架的主要構成由角蛋白轉化為波形蛋白，最終使上皮細胞轉變為間充質細胞表型的過程。上皮性腫瘤細胞在EMT轉化過程中，細胞極性和細胞間黏附性喪失，使細胞獲得以遷移、浸潤為特點的特殊表型，從而導致腫瘤細胞的播散[38]。肝細胞癌HepG2和BEL7402的細胞自噬經饑餓誘導后能抑制上皮細胞標志物的表達，促進細胞間充質標志物的表達及上皮—間充質的轉化，從而促進肝細胞癌的侵襲和轉移。但經氯喹和Atg3或Atg7對肝細胞癌的自噬抑制處理后，肝細胞癌的EMT和侵襲性均受到抑制。EMT在轉化過程中能使Beclin 1重新表達，激活細胞自噬。乳腺癌細胞可通過EMT和自噬的協同作用共同抵抗細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T-lymphocytes，CTL）的殺傷作用[39]。EMT在改變腫瘤細胞表型的過程中能通過誘導自噬作用來使腫瘤細胞逃避機體免疫系統的監測。

微泡分泌是細胞內包含蛋白質的多泡體（multivesicular bodies，MVBs）與細胞膜融合后釋放到細胞外的過程，可以以信號因子的形式進行細胞間的信號傳遞。細胞內多泡體的代謝有三種方式：1）MVBs與溶酶體融合而被降解；2）在病理性刺激下，MVBs能與細胞膜融合，其內的蛋白質作為主要組織相容性復合物Ⅱ類分子（major histocompatibility complex Ⅱ ，MHC-Ⅱ）于細胞膜的表面表達；3）MVBs分泌到細胞外，并以微泡分泌的形式進行細胞間的信號傳遞。微泡分泌對腫瘤細胞的免疫調控起重要作用。B細胞的微泡分泌可以以抗原呈遞的的方式激活CD4+T細胞，同時，樹突狀細胞和腫瘤細胞的微泡分泌過程都具有激活體內抗腫瘤免疫反應作用，能有效地抑制腫瘤的侵襲轉移。因此，微泡分泌在腫瘤的免疫治療領域中受到廣泛關注。在K652細胞微泡分泌的研究中發現，MVBs參與自噬的形成過程，并且在使用聚焦顯微鏡中發現細胞中MVBs過度表達Rab11蛋白和LC3蛋白，Rab11蛋白對自噬體與MVBs的融合起重要作用，而自噬的誘導也可以導致LC3蛋白過度表達，并使MVBs參與到自噬形成的過程中，從而能抑制微泡分泌[40]。網織紅細胞在成熟過程中，一些廢棄的膜蛋白和細胞器被釋放到MVBs中，從而被運送到體外，而這些膜蛋白和細胞器也可以通過自噬的分解代謝作用被消化，因此，在形態學和分子生物學的研究中發現，自噬體先與MVBs融合，然后再與溶酶體融合，從而抑制細胞的微泡分泌[41]。腫瘤細胞的自噬可以通過抑制微泡分泌，來降低機體對腫瘤細胞的免疫監測功能，從而促進腫瘤的侵襲轉移能力。

4 自噬與腫瘤的治療

自噬在腫瘤發生、發展的不同階段中有不同的作用，因此自噬在腫瘤的治療過程中也發揮著不同的作用，正確利用自噬作用可以有效的提高療效，延緩腫瘤復發，但對腫瘤細胞的自噬利用不當，就會產生不良后果。通過抑制或激活腫瘤細胞的自噬進行個體化治療是當今研究的一個熱點。

4.1 抑制自噬在腫瘤治療中的作用

腫瘤細胞的自噬可以降低放療、化療對腫瘤的治療效果，因此可以通過抑制自噬來提高腫瘤細胞對放療、化療的敏感性，從而提高腫瘤的治療效果。自噬抑制治療已經在神經膠質瘤、骨髓瘤、乳腺癌、直腸癌、前列腺癌等多種腫瘤的治療中被證實有效[42]。研究[43]發現，自噬阻滯劑氯喹及其衍生物羥氯喹與DNA烷化劑環磷酰胺結合能夠明顯地增加腫瘤消退率，而且可以顯著延緩腫瘤的復發。同時，氯喹和羥氯喹在腫瘤的放療和化療中具有協同作用。

在口腔鱗癌患者預后的研究中發現，LC3高表達患者的預后比LC3低表達患者的預后差[44]，相同的研究[45]也表明，抑制口腔鱗癌基礎水平的自噬可增強口腔鱗癌化療的敏感性。雷帕霉素以及Beclin 1基因均可通過調控LC3的表達，上調舌鱗癌細胞的自噬水平，從而抑制舌鱗癌的增殖、侵襲和轉移能力。由此可見，不同水平的自噬對口腔鱗癌的的作用不同。目前，口腔鱗癌細胞自噬的分子調控機制以及自噬在口腔鱗癌發展不同階段的作用仍需進一步研究。正確調控口腔鱗癌自噬水平，對口腔鱗癌的治療和預后具有重要臨床意義。

4.2 激活自噬在腫瘤治療中的作用

雖然抑制自噬在腫瘤治療中發揮重要作用，但也有很多腫瘤在激活自噬狀態下對腫瘤的治療有促進作用。在營養缺乏或饑餓情況下，細胞可以通過自噬的分解代謝作用產生營養物質和能量來維持細胞一段時間的生存，但自噬也可以導致細胞體積隨時間而縮小，如果時間過長，就會導致細胞自噬性死亡。

對腎移植患者的回顧性研究發現，雷帕霉素對腫瘤的發生有抑制作用[46]。雷帕霉素及其類似物坦羅莫司是一種mTOR抑制劑，可以選擇性的激活靶細胞的自噬。臨床上雷帕霉素僅在治療腎細胞癌、神經內分泌癌和淋巴瘤中取得成功，雷帕霉素結合細胞毒性化療藥物可以提高腫瘤細胞的死亡，從而提高抗腫瘤的療效。

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