益生菌發酵復方中草藥工藝的研究

馬明侖，陳功義，宋志元，劉三俠，張要齊*

（1.新鄉市畜產品質量監測檢驗中心，河南 新鄉　453003；2.河南農業職業學院；3.河南惠通天下生物工程有限公司）

益生菌發酵復方中草藥工藝的研究

馬明侖1，陳功義2，宋志元3，劉三俠3，張要齊3*

（1.新鄉市畜產品質量監測檢驗中心，河南 新鄉453003；2.河南農業職業學院；3.河南惠通天下生物工程有限公司）

目前，我國畜禽養殖業抗生素的濫用現象日趨嚴重，其所導致的負面效應也日益顯著。因此，開發安全、綠色、無毒的新型飼用抗生素替代品，對我國綠色畜牧業的發展意義重大。中草藥飼料添加劑不僅能提高動物生產性能，而且還具有毒副作用小、殘留低、無抗藥性等優點，已成為目前研究的熱點。發酵作為中草藥的一種炮制方法，能提高中草藥藥效，降低毒副作用，同時產生新的藥效物質。該研究選用黃芪、當歸等中草藥按比例組成復方，利用糞腸球菌對其進行發酵，以粗多糖含量和活菌數為檢測指標，用單因素和正交試驗相結合的試驗設計確定其最佳發酵工藝，為新型飼用抗生素替代品的研制提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

菌種：糞腸球菌（購自中國工業微生物菌種保藏管理中心）；藥材與試劑：中藥材（購自中藥材市場）、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉（購自北京某生物技術有限公司），糞腸球菌肉湯培養基、糞腸球菌瓊脂（購自青島某生物技術有限公司），硫酸、乙醇、蒽酮以及其他試劑均為國產分析純。

1.2試驗儀器

中藥粉碎機；超凈工作臺；數控超聲波提取機；離心機；紫外分光光度計；高壓蒸汽滅菌鍋；電熱恒溫培養箱。

1.3試驗方法

1.3.1菌種活化

挑取兩環斜面保存的糞腸球菌于活化培養基中，37℃條件下培養20～24 h，至對數生長期菌液的濃度為0.8 108～1.0 108CFU/mL時，制備得到一級種子菌液，用于發酵中草藥。

1.3.2復方中草藥發酵培養基的制備

黃芪和當歸粉碎后過80目篩，取復方中草藥粉末10 g加入三角瓶中，然后加入100 mL蒸餾水，同時添加一定比例的葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、無機鹽等營養物質，攪拌均勻，調節pH值為7.0，115℃高壓滅菌15 min，冷卻后備用。

1.3.3復方中草藥的發酵

將制備的一級種子菌液加入復方中草藥發酵培養基中，用封口膜封好，在設定溫度下培養，以粗多糖含量和活菌數為檢測指標，篩選最適接菌量、發酵培養基初始pH值、發酵時間、發酵溫度，再設計正交試驗。發酵液中活菌數的測定采用平板菌落計數法。

1.3.4菌液接種量對復方中草藥發酵的影響

向制備的復方中草藥發酵培養基中接種一級種子液，菌液接種比例分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%，發酵培養基初始pH值7.0，37℃條件下發酵培養72 h，發酵結束后測定粗多糖含量及糞腸球菌活菌數，確定最佳菌液接種量。試驗分為四組，每組3個重復，下同。

1.3.5發酵培養基初始pH值對復方中草藥發酵的影響

分別用0.5M HCl和0.5M NaOH調節復方中草藥發酵培養基初始pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，高壓滅菌，冷卻后接種一級種子菌液，接種量由1.3.4節確定，用封口膜封好，37℃發酵培養72 h，發酵結束后測粗多糖含量及糞腸球菌活菌數，確定發酵培養基最佳初始pH值。

1.3.6發酵時間對復方中草藥發酵的影響

接種一級種子菌液于中草藥發酵培養基中，接種量由1.3.4節確定，發酵培養基初始pH值由1.3.5節確定，用封口膜封好，37℃條件下發酵培養，發酵時間分別為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，發酵結束后測定粗多糖含量及糞腸球菌活菌數，確定最佳發酵時間。

1.3.7發酵溫度對復方中草藥發酵的影響

接種一級種子菌液于復方中草藥發酵培養基，接種量由1.3.4節確定，發酵培養基初始pH值由1.3.5節確定，發酵時間由1.3.6節確定，發酵溫度分別為33℃、35℃、37℃、39℃、41℃，發酵結束后測定粗多糖含量及糞腸球菌活菌數，確定最佳發酵溫度。

1.3.8正交試驗優化復方中草藥的發酵條件

在單因素試驗條件下確定適合復方中草藥發酵的菌液接種量、發酵培養基初始pH值、發酵時間和發酵溫度的最適值。根據單因素試驗結果，選取菌液接種量（A）、發酵培養基初始pH值（B）和發酵時間（C）3個因素，每個因素3個水平進行正交試驗。發酵結束后測定粗多糖含量及糞腸球菌活菌數，確定最佳發酵工藝。

1.3.9葡萄糖標準曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg，置于100 mL的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL葡萄糖標準品溶液。精密量取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL的0.1 mg/mL的標準葡萄糖溶液置于預先編號的10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，然后分別吸取1.0 mL至具塞試管中，置冰水浴中5 min，再迅速加入現配的2%蒽酮-濃硫酸試劑4.0 mL，沸水浴中加熱10 min，迅速置于冰水浴冷卻5 min，室溫靜置5 min，另取蒸餾水1.0 mL，同樣操作作為空白對照，在620 nm處測定吸光度值。通過對數據進行線性回歸，得到回歸方程Y=0.413X-0.015（R2= 0.9999）。

1.3.10粗多糖含量的測定

粗多糖的提取：中草藥烘干后，粉碎，過80目篩，按比例配成12 g放入三角瓶中用玻璃棒攪拌均勻，在超凈工作臺中紫外照射30 min，然后準確稱取0.5 g放入250 mL具塞三角瓶中，加入45 mL 80%乙醇靜置浸泡30 min，并超聲破碎30 min，過濾，多次用75%酒精洗滌藥渣，棄去濾液；將濾渣放入烘箱中烘干，加入2%鹽酸45 mL，沸水浴1 h，冷卻后過濾到100 mL容量瓶中，重復提取1次，合并濾液，用2%鹽酸定容，備用。

粗多糖含量的測定：采用蒽酮-硫酸法。測得發酵前中草藥中粗多糖含量為8.32%。

1.3.11數據處理

試驗所得數據用SPSS19.0進行處理分析。

2　結果與分析

2.1菌液接種量對復方中草藥發酵的影響

圖1　菌液接種量對復方中草藥發酵的影響

不同菌液接種量對復方中草藥發酵的影響如圖1所示。由圖1可知，菌液接種量為5%時，粗多糖含量和活菌數均達到最高值，隨著接種量的繼續增大，兩者均有明顯的降低。因此，單因素條件下5%為最佳菌液接種量。

2.2發酵培養基初始pH值對復方中草藥發酵的影響

不同發酵培養基初始pH值對復方中草藥發酵的影響如圖2所示。當初始pH值＜7.0時，粗多糖含量和活菌數均隨著pH值的增大而逐漸升高；當pH值為7.0時，兩者均達最高。隨著pH值繼續升高，兩者均逐漸下降。因此，單因素條件下pH值7.0為最佳發酵初始pH值。

圖2　發酵培養基初始pH值對復方中草藥發酵的影響

2.3發酵時間對復方中草藥發酵的影響

圖3　發酵時間對復方中草藥發酵的影響

不同發酵時間對復方中草藥發酵的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著發酵時間的延長，粗多糖含量和活菌數均不斷升高，發酵72 h時，兩者均達最高，繼續發酵，活菌數大幅度下降，粗多糖含量也有明顯下降。因此，單因素條件下72h為最佳發酵時間。

2.4發酵溫度對復方中草藥發酵的影響

不同發酵溫度對復方中草藥發酵的影響如圖4所示。由圖4可知，當溫度為37℃時，粗多糖含量和活菌數均達到最高，當發酵溫度繼續升高時，兩者含量降低并逐漸趨于穩定。因此，單因素條件下37℃為最佳發酵溫度。

2.5正交試驗優化復方中草藥的發酵條件

由單因素試驗確定正交試驗各因素的水平值見表1，正交試驗結果見表2。

圖4　發酵溫度對復方中草藥發酵的影響

表1　正交試驗因素與水平

表2　正交試驗結果及極差分析

由表2可以看出，影響發酵后粗多糖含量及活菌數的三個因素的主次順序為：C（發酵時間）＞A（菌液接種量）＞B（發酵培養基初始pH值）。最佳發酵工藝組合為：A2B3C2。方差分析結果表明，發酵時間和菌液接種比例對發酵后粗多糖含量影響差異極顯著（P＜0.01），對活菌數的影響差異顯著（P＜0.05），而發酵培養基初始pH值對兩者的影響均不顯著（P＞0.05）。綜上可知，復方中草藥最佳發酵工藝組合為菌液接種量5%，發酵培養基初始pH值為7.0，時間72 h，發酵溫度37℃。測得此條件下發酵后粗多糖含量為12.26%，糞腸球菌活菌數為7.9 109CFU· mL-1。

3　討論

合適的菌液接種量在發酵工藝優化時十分重要。接種量小，菌體繁殖較慢；接種量過大，則會因營養物質缺乏，導致發酵菌的生長受到抑制，影響發酵效果。該試驗結果表明，接種量對發酵指標的影響呈現先升高后降低的趨勢，這與郭舒等的研究報道一致。

pH值作為影響菌種正常生長繁殖的因素之一，該試驗的最適發酵初始pH值為7.0，這可能由于此pH值條件下，發酵菌種可以大量正常繁殖，抑制了其他雜菌的生長。

發酵時間對發酵產物和發酵后益生菌存活率具有十分重要的影響。時間過短不利于菌種的正常生長繁殖，發酵也不能充分進行；而時間過長，營養物質被大量消耗，影響發酵后活菌數量，同時也容易產生酸味過大、顏色過深等現象，因此，發酵時間并不是越長越好。

合適的溫度對益生菌的生長和發酵十分重要。在適宜的溫度范圍內，發酵溫度越高，益生菌的生長速率越高，菌體數量越多，可以降解中草藥基質產生更多的多糖；若超過最適培養溫度，則益生菌生長速率小于死亡速率，雜菌的生長加快，不斷消耗基質中的多糖，導致基質中多糖含量的降低。

該研究利用益生菌發酵復方中草藥，不僅使中草藥中有效物質最大限度地釋放出來；同時又在發酵產物中保留了大量的益生菌，從而可以充分發揮中草藥和益生菌在動物生產上增強動物機體免疫力和促進動物生長的雙重作用，為替代飼用抗生素的研制提供一定的參考。

4　結論

復方中草藥最佳發酵工藝組合為：菌液接種量5%、發酵培養基初始pH值7.0，時間72 h，發酵溫度37℃。測得此條件下發酵后粗多糖含量為12.26%，糞腸球菌活菌數為7.9 109CFU·mL-1。

S853.73

B

1004-5090201510-0041-03

2015-09-16）

新科工信息［2014］61號（項目編號：2014CXY05）

張要齊（1978-）男，漢族，農業推廣碩士，研究方向：獸藥研發和推廣。