嗜熱脫氮芽孢桿菌產α-半乳糖苷酶影響因素的研究

韋陽道，易　弋，石征宇，鄧　春，伍時華，黎　婭*（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006）

嗜熱脫氮芽孢桿菌產α-半乳糖苷酶影響因素的研究

韋陽道，易弋，石征宇，鄧春，伍時華，黎婭*
（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006）

該文對前期篩選出的嗜熱脫氮芽孢桿菌YWX5產α-半乳糖苷酶的影響因素進行了初步的研究，通過測定α-半乳糖苷酶酶活，探究了培養基成分（包括碳源、氮源、無機鹽）及培養條件（初始pH值、培養溫度、培養時間）對該嗜熱脫氮芽孢桿菌產α-半乳糖苷酶能力的影響。實驗結果表明，對該菌產酶最有效的碳源為3%豆粕，氮源為0.5%硝酸鉀，附加氮源為0.5%酵母浸出物；添加0.5%氯化鈉和0.1%磷酸氫二鉀有助于該菌產酶。另外，該菌最佳產酶培養溫度為60℃，培養基最適初始pH在7.0～8.0，培養時間為65 h。

嗜熱脫氮芽孢桿菌；α-半乳糖苷酶；酶活；影響因素

α-半乳糖苷是由一個蔗糖單位（果糖-葡萄糖）與一個或多個α-D-半乳糖分子以α-D-1，6-糖苷鍵連接構成的低聚糖類物質，主要有三糖棉子糖（raffinose）、四糖水蘇糖（stachyose）和五糖毛蕊花糖（verbascose）等。α-半乳糖苷類物質在植物性飼料中廣泛存在，其中在豆類飼料中含量最高［1］。由于其不能被動物所利用，間接影響了飼料的利用率，同時會在消化道后端由微生物發酵作用，而引起動物消化不良、氣脹等不良的影響，這些都比較大大的降低了飼料的飼用價值［2-5］。α-半乳糖苷酶（α-galactosidase）E.C. 3.2.1.22是一種生物催化劑，它能夠特異性催化α-半乳糖苷類物質末端的α-1，6-半乳糖苷鍵的水解從而釋放出半乳糖被動物所利用［6］，大大降低豆類飼料引發的幼齡動物腹瀉現象，增強動物的免疫功能和抗病能力，減輕了消化器官代償性增生和肥大，對于提高飼料能量效價有非常大的作用，因此被認為是第三代飼料酶。由于飼料加工過程中有高溫工藝，會導致酶失活，因此，熱穩定性好的α-半乳糖苷酶因其特殊性逐漸引起了飼料工業的關注。在前期的工作中，課題組分離出一株嗜熱脫氮芽孢桿菌YWX5，其具有產α-半乳糖苷酶的特性，并且酶的熱穩定性較好［7］。本研究在此基礎上，進一步探究了培養基成分（碳源、氮源、無機鹽）及培養條件（初始pH值、培養溫度、培養時間）對菌株YWX5產α-半乳糖苷酶的影響，為該菌株的工業化應用提供一定的理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

嗜熱脫氮芽孢桿菌（Geobacillus thermodenitrificans）YWX5：廣西科技大學發酵工程研究室分離并保藏。

1.1.2化學試劑

對硝基酚標準品：科密歐化學試劑有限公司；4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）：上海藍季科技發展有限公司；蛋白胨（99.5%）：北京奧博星生物技術有限責任公司；檸檬酸（99.5%）：廣東達濠精細化學品公司；磷酸氫二鈉（99.0%）：天津博迪化工股份有限公司。

檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 7.0）：0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液16.47 mL和0.1 mol/L檸檬酸溶液3.53 mL混合，稀釋至80 mL。

1.1.3培養基

初始發酵培養基參考文獻［8］略做修改：2%豆粕加水沸水煮1 h后冷卻，4 000 r/min離心除去沉淀得上清，0.5% KNO3，0.1%K2HPO4；使用1mol/L的氫氧化鉀溶液和1mol/L的硝酸溶液調pH值為7.0，于121℃滅菌20 min。

LB種子液培養基：1%NaCl，1%蛋白胨，0.5%酵母浸出液，于121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設備

UV-1100紫外/可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；ZFD-5250全自動新型鼓風干燥箱、HWY-2112全溫度恒溫調速搖床柜：上海智城分析儀器制造有限公司；Micro 220R臺式冷凍離心機：德國HETTICH公司；LRH-250生化培養箱：廣東省醫療器械廠。

1.3實驗方法

1.3.1酶活的測定及標準曲線的繪制

α-半乳糖苷酶的測定采用紫外可見分光光度法。

（1）對硝基酚標準曲線的制作

精確配制一系列濃度梯度（0.05 μmol/L、0.10 μmol/L、0.15μmol/L、0.20μmol/L、0.25μmol/L）的對硝基酚標準品，取0.5 mL標準品加入1.6 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 7.0），再加入2 mL 1 mol/L的Na2CO3，混合均勻后于波長405 nm處測OD405nm值［9］。

（2）α-半乳糖苷酶酶活的測定方法

將嗜熱脫氮芽孢桿菌YWX5培養液于4℃、4 500 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。取粗酶液0.1 mL，加入0.2 mL 5 mmol/L的底物p-NPG，加入1.8 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 7.0）使反應體系體積為2.1 mL，于65℃精確反應10 min，立即加入2 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液中止反應。對照組先加入Na2CO3溶液中止反應再加入底物，其他同實驗組?；旌暇鶆蚶鋮s至室溫于波長405 nm處測OD405nm值［10］，再按照對硝基酚標準曲線回歸方程計算對硝基酚的量，從而計算酶的活力，其計算公式如下：

式中：A為α-半乳糖苷酶酶活，U/mL；y是根據標準曲線回歸方程所得的對硝基苯酚濃度，μmol/L；N為酶液稀釋倍數；V為反應所用的酶量，mL；t為反應時間，min。

酶活力單位定義：在標準條件下（pH值為4.5、37℃），每分鐘釋放出1 μmol產物對硝基酚所需的酶量為一個酶活單位（U）。每個反應設置3個平行樣。

1.3.2碳源對嗜熱脫氮芽孢桿菌產酶能力的影響

（1）不同種類的碳源對產酶能力的影響

分別以含量為2%的蔗糖、棉子糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖、木糖、1%葡萄糖+1%的棉子糖為碳源代替初始發酵培養基中2%的豆粕，將菌株（20μL的種子接種于10mLLB培養基中培養18 h）按2%接種量接種于各培養基中于60℃培養2 d，以未接種的培養基為對照測定培養液OD600nm及上清液酶活，考察不同碳源對菌株產酶能力的影響。

（2）豆粕含量對菌株產酶能力影響

將初始發酵培養基中2%的豆粕含量設置為1%～5%，將菌株等量接種于各培養基中于60℃培養2 d，以未接種的培養基為對照測定培養液OD600nm及上清液酶活，考察豆粕質量濃度對菌株產酶能力的影響。

（3）附加碳源對菌株產酶能力影響

在最優豆粕含量培養基中加入0～4%的棉子糖作為附加碳源，其他操作同上，考察附加碳源對菌株產酶能力的影響。

1.3.3氮源對嗜熱脫氮芽孢桿菌產酶能力的影響

（1）不同種類的氮源對菌株產酶能力的影響

分別以0.5%蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白、大豆蛋白、（NH4）2SO4為氮源代替初始發酵培養基中的0.5%的KNO3，其他組分不變，考察不同氮源對菌株產酶能力的影響。

（2）硝酸鉀含量對菌株產酶能力的影響

將初始培養基中的0.5%的KNO3設置為0.3%～1.5%含量范圍，其他組分不變，考察不同硝酸鉀含量對菌株產酶能力的影響。

（3）附加氮源對菌株產酶能力的影響

在初始發酵培養基中加入含量0～1%的酵母浸出物，其他組分不變，考察不同的酵母提取物對菌株產酶能力的影響。

1.3.4無機鹽對嗜熱脫氮芽孢桿菌產酶能力的影響

分別以0.5%NaCl、0.1%K2HPO4、0.01%CaCl2、0.01% MgSO4、0.001%MnSO4、0.001%FeSO4代替初始發酵培養基中的磷酸氫二鉀（各無機鹽含量參考文獻［11］），以不加無機鹽的初始培養基作為對照組，其他組分不變，考察不同含量無機鹽對菌株產酶能力的影響。

1.3.5培養溫度對嗜熱脫氮芽孢桿菌產酶能力的影響

將菌株按2%的接種量接種于初始發酵培養基中，然后分別于40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃培養2 d，以未接種的培養基為對照測定培養液OD600nm及上清液酶活，考察不同培養溫度對菌株產酶能力的影響。

1.3.6培養基初始pH值對嗜熱脫氮芽孢桿菌產酶能力的影響

將菌株按2%的接種量接種于初始pH值為5、6、7、8、9的初始發酵培養基中于60℃培養2 d，以未接種的培養基為對照測定培養液OD600nm及上清液酶活，考察不同培養初始pH值對菌株產酶能力的影響。

1.3.7培養時間對菌株產酶能力的影響

將菌株按2%的接種量接種于初始發酵培養基中，然后分別在60℃培養5 h、8 h、16 h、22 h、25 h、30 h、32 h、41 h、45 h、50 h、55 h、65 h、70 h、75 h、80 h、90 h，以未接種的培養基為對照測定培養液OD600nm及上清液酶活，考察不同培養時間對菌株產酶的影響。

2　結果與分析

2.1對硝基酚標準曲線的繪制

以對硝基酚標準品濃度（y）為縱坐標，波長405 nm處的吸光度值（x）為橫坐標，繪制對硝基酚標準曲線，結果見圖1。

圖1　對硝基酚標準曲線Fig.1 Standard curve of p-nitrophenol

由圖1可知，對硝基酚標準曲線的回歸方程為y= 0.227 7x+0.004 6，相關系數R2=0.998 9，表明二者線性關系良好。

2.2碳源對產酶能力的影響

2.2.1不同碳源對產酶能力的影響

圖2　不同碳源對菌株產酶及生長的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on α-galactosidase production and strain growth

菌株YWX5在相應培養基上培養2 d后測定OD600nm及酶活所得的結果見圖2，由圖2可知，不同種類的碳源對嗜熱脫氮芽孢桿菌的產酶及生長能力的影響有很大差異。該菌在以棉子糖為碳源的培養基上產酶能力較強（0.018U/mL），以蔗糖及葡萄糖為碳源時也能產生一定的α-半乳糖苷酶，分別為0.002 U/mL和0.001 U/mL。其他糖類如乳糖、麥芽糖、果糖、木糖、葡萄糖+棉子糖作為碳源并不能誘導該菌產酶。使用糖類作為唯一碳源即使培養2 d后菌株的最高酶活也僅有0.019U/mL，最高生物量OD600nm值也只有0.112，這說明僅僅利用單一糖類作為碳源并不能滿足嗜熱脫氮芽孢桿菌生長及產酶的營養需求，故本實驗以豆粕（酶活為0.161 U/mL，OD600nm值為0.483）作為碳源的基礎成分。

2.2.2不同含量的豆粕對產酶的影響

不同含量的豆粕對產酶的影響見圖3，由圖3可知，當豆粕含量1%～3%，隨著豆粕含量的增加酶活也相應的增加；當豆粕含量為3%時，酶活及生物量達到最高（平均酶活=0.215 U/mL，OD600nm=0.530）；當豆粕含量＞3%時，生物量隨豆粕含量的增加呈現先增加后減少的趨勢。故該菌在豆粕含量為3%的培養基上生長和產酶能力最佳。

圖3　不同豆粕添加量對菌株產酶及生長的影響Fig.3 Effect of different soybean meal addition on the α-galactosidase production and strain growth

2.2.3附加碳源對產酶的影響

圖4　不同棉子糖添加量對菌株產酶及生長的影響Fig.4 Effect of different raffinose addition on the α-galactosidase production and strain growth

據報道，在培養基中加入一定質量濃度的棉子糖可以進一步提高α-半乳糖苷酶的產量［9］。許堯興等［12］在研究中發現在麩皮和豆粕粉（質量比為7∶3）的培養基中加入2%的棉子糖可以進一步使黑曲霉變種α-半乳糖苷酶的的產量提高16%。但是在本實驗中，3%豆粕的基礎培養基上加入0～4%的棉子糖并不能促進該菌產α-半乳糖苷酶（見圖4），反而呈現略微抑制的現象。這可能是因為豆粕中已經含有大量的棉子糖，該菌對棉子糖的需求已經達到飽和，所以再加入棉子糖已經不能再對該菌產酶產生促進作用。因此培養基中不再加入棉子糖。

2.3氮源對產酶能力的影響

2.3.1不同氮源對產酶能力的影響

不同氮源對菌株產酶能力的影響見圖5。由圖5可知，可以看出氮源對菌株YWX5產酶的促進能力由高到低依次為KNO3（0.161 U/mL）、酵母浸出物（0.099 U/mL）、蛋白胨（0.073 U/mL）、（NH4）2SO4（0.069 U/mL）、大豆蛋白（0.055 U/mL）、酪蛋白（0）。故以KNO3為氮源。從生物量明顯可以看出也是KNO3（OD600nm=0.482）的效果最佳，其次是大豆蛋白（OD600nm=0.347）。另外，嗜熱脫氮芽胞桿菌在酪蛋白培養基上可以生長（OD600nm=0.198）卻不能產生α-半乳糖苷酶。由此可見，以KNO3為氮源最佳。

圖5　不同氮源對菌株產酶及生長的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on the α-galactosidase production and strain growth

2.3.2硝酸鉀含量對產酶能力的影響

圖6　不同硝酸鉀含量對菌株產酶及生長的影響Fig.6 Effect of different KNO3addition on the α-galactosidase production and strain growth

硝酸鉀含量對產酶能力的影響見圖6。由圖6可知，當硝酸鉀含量為0.5%時產酶最佳，酶活達到0.153 U/mL，此時菌液OD600nm為0.436，繼續增加硝酸鉀的含量只有輕微的刺激菌體生長的作用，且產酶量會有所下降。因此0.5%的硝酸鉀是最佳含量。

2.3.3附加氮源對產酶能力的影響

在以0.5%硝酸鉀為氮源的培養基中加入0～1%的酵母浸出物，隨著其添加量增高，菌株產酶能力也相應提高，直至酵母浸出物添加量為0.5%（0.263 U/mL）時，酶活不再升高（見圖7）。但是生物量卻是先升高后下降，這可能是因為營養增加后菌株的生長加快，以致檢測時菌株的生長周期已進入衰亡期。因此培養基中添加0.5%的酵母浸出物有利于菌株產酶能力的提高。

圖7　不同酵母浸出物添加量對菌株產酶及生長的影響Fig.7 Effect of different yeast extracts addition on the α-galactosidase production and strain growth

2.4無機鹽對產酶能力的影響

圖8　不同無機鹽對菌株產酶及生長的影響Fig.8 Effect of different inorganic salts on the α-galactosidase production and strain growth

無機鹽對菌株產酶能力的影響見圖8。由圖8可知，當培養基中加入NaCl和K2HPO4時產酶有所提高，加入其他無機鹽（如CaCl2、MgSO4、MnSO4、FeSO4）時對菌株產酶能力作用影響較小，LEE J等［11］在研究芽孢桿菌LX-1產α-半乳糖苷酶時發現培養基中加入一定濃度無機鹽幾乎都可以在一定程度上加強產酶，尤其加入硫酸錳可以大幅度提高酶產量，但是本實驗并未得到類似的結果，這說明不同微生物產α-半乳糖苷酶所需要的無機鹽的種類有所差別。因此培養基中加入NaCl和K2HPO4有利于YWX5產酶能力的增強。

2.5培養溫度對產酶能力的影響

溫度對嗜熱脫氮芽孢桿菌YWX5產酶及生長的影響如圖9所示。由圖9可知，該菌在50～70℃內都能夠生長及產酶，并且隨著培養溫度的改變，菌株產酶及生長的變化趨勢幾乎一致。40℃時幾乎不生長不產酶，隨著溫度的升高該菌生物量及產酶均增長，當培養溫度為60℃時達到最大產酶量0.156 U/mL，最大OD600nm為0.462。繼續升高培養溫度，產酶量及生物量均有所下降。因此，該菌產酶及生長的最佳溫度條件為60℃。

圖9　培養溫度對菌株酶活及生長的影響Fig.9 Effect of culture temperature on α-galactosidase production and strain growth

2.6培養基初始pH值對嗜熱脫氮芽孢桿菌產酶能力的影響

培養基初始pH值對菌株產酶能力的影響見圖10。由圖10可知，隨著pH值的改變，該菌產酶及生物量的變化趨勢幾乎一致，呈現先增加后減小的趨勢，在pH值為7.0～8.0時，該菌產α-半乳糖苷酶的酶活和生物量相差無幾，達到最大（pH7.0（0.158 U/mL，OD600nm=0.45）～8.0（0.158 U/mL，OD600nm=0.48）），所以最適初始pH值應在7.0～8.0。

圖10　初始pH值對菌株產酶及生長的影響Fig.10 Effect of initial pH on α-galactosidase production and strain growth

2.7培養時間對菌株產酶能力的影響

培養時間對菌株產酶能力的影響見圖11，由圖11可知，菌株在8～32h生物量迅速增長，之后變得緩慢，在45～55 h基本維持穩定，其中在50h時菌株生物量達到最大。而酶活在8～50 h增長迅速，之后增長變得緩慢，在55～70 h基本維持穩定，其中在65 h時酶活達到最大（0.215 U/mL）。因此，培養時間65 h為菌株產酶的最佳時間。

圖11　培養時間對菌株產酶及生長的影響Fig.11 Effect of culture time on α-galactosidase production andstrain growth

2.8討論

α-半乳糖苷酶是一種誘導酶，誘導物通常是底物或底物類似物。目前，國內外對于α-半乳糖苷酶的分子調控機制已有一定的研究［13-14］，雖然不同來源的α-半乳糖苷酶的表達及調控模式是不同的，但都是通過一個或多個操縱子（分別）調節一個或多個結構基因來實現的，誘導物通過與阻遏蛋白作用而使阻遏蛋白不能發揮功能，進而使α-半乳糖苷酶結構基因可以正常轉錄表達。在已報道的研究中葡萄糖對α-半乳糖苷酶的產生有一定的抑制作用［15］，研究者認為葡萄糖通過分解代謝物阻遏的方式來抑制α-半乳糖苷酶的產生。本實驗利用葡萄糖與另一誘導物（棉子糖）一起作為碳源來培養該嗜熱脫氮芽孢桿菌，得到的結果與已報道的研究結果類似，即葡萄糖對α-半乳糖苷酶的的產生有抑制作用，但是其對該酶的抑制程度要比已報道的酶強很多，產酶量甚至不如單一加入葡萄糖的情況。在黑曲霉等真菌中，蔗糖是很好的誘導因子［16］，也有報道指出麥芽糖對部分菌種產α-半乳糖苷酶有較好的誘導作用［11］，而在本實驗中蔗糖和麥芽糖的誘導能力遠遠比不上棉子糖，這可能是因為微生物差異造成的。在生長方面，蔗糖促進該菌生長的情況相對較優，其次是棉子糖。除了碳源外，氮源對微生物的生長、生理等也是至關重要的。已有報道指出有機和無機混合氮源通常都能在一定程度上提高菌株的產α-半乳糖苷酶能力［11］，本實驗也得到類似的結果，當KNO3與酵母浸出物混合使用時，菌株YWX5的產酶能力進一步提高。此外，該菌的耐熱性較好，在70℃條件下培養仍然能夠生長及產酶，最適培養及產酶溫度為60℃，這大大降低了細菌培養時雜菌污染的危險。但菌株YWX5在40℃時不生長，高溫培養所需的能耗也阻礙了該菌的應用。

3　結論

本文通過對YWX5的產酶能力的研究，得出該菌產酶最有效的碳源為3%豆粕、氮源為0.5%硝酸鉀、附加氮源為0.5%酵母浸出物，培養基中添加0.5%氯化鈉和0.1%磷酸氫二鉀有助于該菌產酶。另外，該菌最佳產酶培養溫度為60℃，培養基最適初始pH在7.0～8.0，培養時間為65 h。雖然本研究對于提高該嗜熱脫氮芽孢桿菌YWX5的α-半乳糖苷酶產量有一定成效，但是單位體積（1 mL）內的粗酶液活性與其他已報道菌株相比還是偏低［16］。微生物發酵的影響因素眾多，要大幅度提高菌株YWX5α-半乳糖苷酶的產量，還需對其發酵條件及調控機制進行深入的研究。此外，考慮到該菌不能在低溫條件下生長，不利于工業應用，采用基因工程手段獲得α-半乳糖苷酶高效表達的工程菌株可能是該嗜熱酶實現應用的有效手段。

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Influencing factors ofGeobacillus thermodenitrificanson α-galactosidase-production

WEI Yangdao，YI Yi，SHI Zhengyu，DENG Chun，WU Shihua，LI Ya*
（College of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China）

The influencing factors of the preliminarily screenedGeobacillus thermodenitrificansYWX5 on α-galactosidase production were studied. By the α-galactosidase activity determination，the effect of medium composition（including carbon sources，nitrogen sources and initial pH），culture temperature and time on α-galactosidase production ofG.thermodenitrificansYWX5 was investigated.The results showed the most effective carbon source was soybean meal 3%，the most effective nitrogen source was KNO30.5%，and enzyme production was promoted by supplementation with yeast extracts 0.5%as extra nitrogen source；it was also enhanced by supplementation with NaCl 0.5%and K2HPO40.1%.In addition，the optimal culture temperature，time and initial pH of the medium for the α-galactosidase-producing strain were 60℃，65 h and 7.0-8.0，respectively.

Geobacillus thermodenitrificans；α-galactosidase；enzyme activity；influencing factors

TQ920.1

A

0254-5071（2015）11-0113-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.026

2015-10-03

廣西科學基金（2014GXNSFAA118086）；廣西科學基金（2015GXNSFBA139068）

韋陽道（1989-），男，碩士研究生，研究方向為微生物分子生物學。

黎婭（1980-），女，助理研究員，碩士，研究方向為微生物學。