馬奶酒發酵劑用菌種的篩選研究

GAN-OD NAMNANSUREN，徐　敏，霍貴成*（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

馬奶酒發酵劑用菌種的篩選研究

GAN-OD NAMNANSUREN，徐敏，霍貴成*
（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

采用乳酸菌聯合酵母的發酵方法，制備一種新型馬奶酒并為工業化生產馬奶酒提供新型發酵劑。通過考察8%酵母菌（F1）、6%酵母菌聯合2%嗜酸乳桿菌（F2）、6%酵母菌聯合2%瑞士乳桿菌（F3）、6%酵母菌聯合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4）以上四種發酵菌種配比，以酒精度、酸度、感官品質為考察指標，開發適合馬奶酒工業化生產的優良發酵劑。結果表明，當采用6%酵母菌聯合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4）的發酵方式時，馬奶酒酒精度為1.39%vol，馬奶酒酸度為90°T，感官評分為91分，且馬奶酒香醇可口、組織均勻，適于大眾飲用；因此6%酵母菌聯合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌，可作為工業化生產馬奶酒所用的發酵劑。

乳酸菌；酵母；發酵劑；馬奶酒

馬奶酒是用鮮馬奶經過發酵變酸釀制而成的飲料；其最早始于秦漢時代，歷史悠久，味道酸辣，被稱為元玉漿，是“蒙古八珍”之一［1］。馬奶酒性溫，有驅寒、舒筋、活血、健胃等功效［2］。傳統的馬奶酒是在鮮馬奶中加入天然發酵劑，經自然發酵形成，呈乳白色的、質地均勻的飲料［3］。馬奶酒作為一種中國特色飲料，逐漸受到大眾的喜愛；隨著人民生活節奏的不斷加快，市場迫切需要將這種傳統方便飲料工業化生產，其中發酵劑在馬奶酒的加工過程中起著至關重要的作用［4］。然而，傳統天然發酵劑很大程度上影響馬奶酒的工業化生產；目前國外對于新發酵劑的開發很多依靠基因工程，但是其應用受到消費者和歐盟的阻礙［5］。因此，傳統的篩選和鑒定方法對于馬奶酒發酵劑的開發仍起著一定程度的作用［6］。根據文獻，酵母菌聯合乳酸菌制備馬奶酒時，且酵母菌含量為2/3時，馬奶酒品質較好［7-10］，因此該實驗考察酵母菌（F1）、酵母菌聯合嗜酸乳桿菌（F2）、酵母菌聯合瑞士乳桿菌（F3）、酵母菌聯合兩種乳桿菌（F4）四種發酵劑，以酒精度、酸度、感官品質為評價指標，開發適合馬奶酒工業化生產的優良發酵劑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種及來源

本研究選擇接種比例為：F1（酵母菌8%）；F2（酵母菌6%∶嗜酸乳桿菌2%）；F3（酵母菌6%∶瑞士乳桿菌2%）；F4（酵母菌6%∶嗜酸乳桿菌1%∶瑞士乳桿菌1%）。

酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）：市售；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）：乳品科學教育部重點實驗室。

1.1.2培養基

MRS培養基：蛋白胨5 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1.1 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸氫二氨2 g、乙酸鈉5 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g，蒸餾水950 mL。固體培養基添加1.6%的瓊脂粉，121℃高壓滅菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3主要試劑

蛋白胨、牛肉膏：北京奧博星生物技術有限公司；胰蛋白胨、酵母粉：英國OXOID公司；葡萄糖：天津光復科技發展有限公司；磷酸氫二鉀：天津光復科技發展有限公司；硫酸錳、檸檬酸氫二胺、乙酸鈉（均為分析純）：天津東麗區天大化學儀器廠；Tween-80：天津光復精細化工研究所；營養瓊脂：天津光復科技發展有限公司。

1.2儀器與設備

DU800紫外可見分光光度計：美國BECKMAN公司；GL-21M離心機：上海市離心機械研究所；DHP-9272電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；PL2002電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HVE-50全自動高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；XK96-A快速混勻器：姜堰市新康醫療器械有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1新型馬奶酒生產工藝流程

1.3.2操作要點

（1）馬奶的驗收：產自健康奶牛乳房，細菌數低、體細胞數低、乳成分正常、無抗生素殘留、無沉淀物和異味、不摻水的自然馬乳；驗收后4℃保存備用［11］。

（2）菌種的活化：將從-20℃冰箱中取出乳酸菌及酵母菌粉，以2%的接種量分別接種到5mL的液體培養基中進行活化，37℃培養14 h后，用混勻器將培養液充分混勻，用接種環在培養液中輕沾少許液體，在固體培養基上進行三區劃線，然后進行培養［12］。

（3）乳酸菌發酵液的制備：將-20℃冰箱保存的嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌取出，分別接種于MRS液體培養基內，37℃培養24 h，傳代2～3次后，取穩定期初的嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌菌液，于4℃儲存，備用。

（4）酵母發酵液的制備：無菌環境下將酵母菌接種于YPD培養基中活化，置于28℃培養48 h，于4℃儲存，備用。

考慮到乳酸菌及酵母菌的最適生長溫度及其生長曲線，馬奶酒的發酵溫度定為37～40℃，發酵時間定為12～14h。

1.3.3菌體及菌落形態的觀察及生長曲線測定

菌株在MRS固體培養基上培養24 h后，選取一個較大菌落，挑取其中的1/2菌落，進行革蘭氏染色和淮鏡觀察，并照相；酵母菌原理同上。

用接種環挑取另外的1/2菌落，接種于MRS液體培養基中，培養約14 h，以2%的接種量接種于MRS液體培養基中，培養約14 h時，再以2%接種量分別接種于54個盛有MRS液體培養基的試管中，并在54個試管分別標上0、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h（共18個時間段，每個時間段3個平行），37℃恒溫培養，從起點開始計時當，到達上述時間時，將對應的3支試管取出放入4℃冰箱中，待18個時間段全部取出后一起用紫外分光光度計測定吸光度值；采用梯度平板稀釋法測定0～30 h內的活菌數，重復3次，作生長曲線。酵母菌原理同上。

1.3.4分析測定方法

酒精度的測定用酒精計進行測定；酸度測定用酸堿滴定法進行測定［2-4］。

1.3.5馬奶酒感官的評定

采用綜合評分法，在有明亮自然光、溫度為25℃的房間內進行馬奶酒感官評定。根據口感（35分），香味（35分），組織狀態（20分），色澤（10分）進行綜合評分，滿分100分［14-15］。評定方法：隨機選取50名性別不同、年齡各異、語言表達能力強的人員進行感官評價，排除偏差，試驗結果取平均值，然后進行分析，馬奶酒的感官評分標準見表1。

表1　馬奶酒的感官評分標準Table1 Sensory evaluation standards of kumiss

2　結果與分析

2.1菌株生長曲線

分別將三株菌接種于液體培養基中，以培養時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制3株菌的生長曲線，結果見圖1。

由圖1可知，瑞士乳桿菌在培養4 h時開始迅速生長，進入生長的對數期，在16 h后進入生長的相對穩定期，菌體生長緩慢，瑞士乳桿菌在28 h時進入衰退期；嗜酸乳桿菌在3 h時開始迅速生長，進入生長的對數期，14 h進入穩定期，未檢測出衰退期；酵母菌在培養2 h時開始迅速生長，進入生長的對數期，在14 h后進入生長的相對穩定期，菌體生長緩慢，酵母菌在28 h時進入衰退期。因此，本研究發酵制備馬奶酒采用三株菌的發酵時間分別為：瑞士乳桿菌為16 h，嗜酸乳桿菌為14 h，酵母菌為14 h。

圖1三株菌的生長曲線
Fig. 1 Growth curves of three strains

2.2不同菌株發酵過程對馬奶酒酒精度的影響

在馬奶酒生產中，除了酵母菌及根據需要所接種的微生物外，還有其他多種微生物的作用，如作為糖化曲的乳酸菌菌種。其中，酵母菌的主要作用是參與酒精發酵。不同菌種發酵對馬奶酒酒精度的影響結果見圖2。由圖2可知，當酵母菌所占的比例較少時，馬奶酒的酒精含量較低，酒精積累量隨添加酵母菌比例的增大而升高，當酵母菌接種量為8%時，馬奶酒的酒精含量最高為1.69%vol，說明大量的糖與酸都轉化成了酒精；然而，6%酵母菌聯合2%嗜酸乳桿菌（F2）與6%酵母菌聯合2%瑞士乳桿菌（F3）和6%酵母菌聯合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4）所得的產品酒精度差異顯著（P＜0.05）。

圖2　不同發酵方式對馬奶酒酒精度的影響Fig.2 Effect of different fermentation methods on alcohol content of kumiss

2.3不同菌株發酵過程對馬奶酒酸度的影響

酵母菌進行酒精發酵后，乳酸菌（如植物乳桿菌、瑞士乳桿菌）可以進一步的以L-蘋果酸為底物通過蘋果酸-乳酸酶將其轉化為L-乳酸；馬奶酒的酸性物質主要由乳酸菌產生，乳酸菌除產生乳酸外，還產生少量的乙酸、甲酸、丙酸等酸性物質。不同菌種發酵對馬奶酒酸度的影響結果見圖3。由圖3可以看出，當接種菌種全部為酵母菌時，馬奶酒的酸度最低，隨著乳酸菌的接入，馬奶酒的酸度增大，可能是由于乳酸菌發酵產生了乳酸，降低了馬奶酒的酸度。當接種6%酵母菌聯合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4）時，馬奶酒的酸度達到最大，達到90°T，接種6%酵母菌聯合2%嗜酸乳桿菌（F2）、與6%酵母菌聯合2%瑞士乳桿菌（F3）兩種發酵方式所得的馬奶酒酸度次之，且無顯著差異。

圖3　不同發酵方式對馬奶酒酸度的影響Fig.3 Effect of different fermentation methods on the acidity of kumiss

2.4不同菌株發酵過程對馬奶酒品質的影響

圖4　不同發酵方式對馬奶酒感官評分的影響Fig.4 Effect of different fermentation methods on the sensory evaluation score of kumiss

由于乳酸菌的代謝會改變酒中醛類、酯類、氨基酸、維生素等微量成分的含量及呈香物質的含量。并且，乳酸菌還會產生一些微量的醇、醛、酯、酚等呈香物質。發酵過程的主發酵期主要是高溫乳酸菌生長、代謝，后發酵期主要是低溫乳酸菌的作用，這時部分高溫乳酸菌死亡、自溶，給酵母菌和低溫乳酸菌提供營養，也就是乳酸菌與酵母菌相互作用，推動馬奶酒發酵，增強馬奶酒口味的豐滿性和濃厚感，形成馬奶酒優良的品質。不同菌種發酵對馬奶酒酸度的影響結果見圖4，由圖4可以看出，酵母菌接種量為8%時，馬奶酒的感官評分較低，顯著差別于接種6%酵母菌聯合2%嗜酸乳桿菌（F2）、6%酵母菌聯合2%瑞士乳桿菌（F3）、6%酵母菌聯合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4），其中，F2、F3、F4三種馬奶酒的發酵方式之間感官評分差異不顯著，以6%酵母菌聯合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4）的發酵方式制出的馬奶酒感官評分最高，達91分。

3　結論

在馬奶酒的生產中，發酵劑的主要作用是產酸、產酒精，以及改善馬奶酒的質構及促進風味物質形成，因此選擇合適的發酵劑對馬奶酒的工業化生產尤為重要。通過對菌株一定程度的活化、培養，得到最佳狀態的酵母菌、嗜酸乳桿菌及瑞士乳桿菌，然后綜合不同指標，如產酒精度、產酸及馬奶酒感官品質，研究不同發酵方式對馬奶酒的影響，從而篩選出最佳馬奶酒發酵劑。試驗結果表明，當發酵劑為F4（即6%酵母菌聯合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌）時，馬奶酒酒精度為1.39%vol，馬奶酒酸度為90°T，感官評分達到91分，且馬奶酒品質最佳，因此，確定馬奶酒工業化生產發酵劑為6%酵母菌聯合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌。

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Screening of starter culture of kumiss

GAN-OD NAMNANSUREN，XU Min，HUO Guicheng*
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Using lactic acid bacteria and yeast co-fermentation method，a new kind of kumiss was developed and new starter was prepared for industrial production.The effect of four starter culture inoculums：yeast 8%（F1），yeast 6%andLactobacillus acidophilus2%（F2），yeast 6%andLactobacillus helveticus2%（F3），and yeast 6%withL.acidophilus1%andL.helveticus1%（F4）on alcohol content，acidity and sensory evaluation quality was investigated.Results showed that when using yeast 6%withL.acidophilus1%andL.helveticus1%as starter，the alcohol content of kumiss was 1.39%vol，the acidity was 90°T，and the sensory evaluation score was 91.The product was sweet and delicious，the organization was uniform which was suitable for people.So yeast 6%withL.acidophilus1%andL.helveticus1%was the optimal starter for kumiss.

lactic acid bacteria；yeast；starter；kumiss

TS261.1

A

0254-5071（2015）11-0095-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.022

2015-10-10

農業部公益性行業（農業）科研專項（201203009）

GAN-OD NAMNANSUREN（1986-），男，碩士研究生，研究方向為食品科學。

霍貴成（1958-），男，教授，博士，研究方向為食品科學。